基于JNK通路研究改良型富血小板纤维蛋白与β-三磷酸钙复合物诱导成骨的机制

付冬梅，王 浪，周 婧，王 劲，杨 昕，李素兰，兰 红

（资阳市雁江区人民医院口腔科，四川 资阳 641300）

骨缺损的传统治疗方法有骨水泥+ 螺钉技术、自体骨移植、同种异体骨移植等，但均存在愈合速度慢、疗效差等缺点，因此近年来发展迅速的骨组织工程开始应用于骨缺损的修复治疗中[1]。虽然在骨缺损处植入骨组织材料对骨缺损的修复具有促进作用，但大部分骨代替材料只有引导成骨作用，材料成本昂贵，且存在免疫反应和疾病传播的风险[2]。本团队前期研究发现，利用血液浓聚物中提取的生物材料进行改良富血小板纤维蛋（A-PRF）被证实可促进软硬组织的愈合及再生，与β- 三磷酸钙（β-TCP）结合为复合物后能有效应用于口腔颌面外科、整形外科、运动医学、牙周病学等多个领域[3]。作为改良型复合物，A-PRF 与β-TCP 复合物在诱导成骨方面已被证实效果比普通PRF 更佳，但详细机制尚未明确。有研究发现，c-Jun 氨基末端蛋白激酶（JNK）通路对骨分化与骨形成有促进作用，也能诱导骨形成蛋白（BMPs）的合成，促进成骨。目前发现骨形成蛋白2（BMP-2）可通过干预JNKs 而增加调控成骨的关键转录因子Osx 的表达，而骨形成蛋白9（BMP-9）是目前已知的BMPs 诱导成骨中最强的因子，BMP-9 具有促进干细胞体内外成骨的作用[4-5]。因此我们猜测A-PRF 与β-TCP 复合物可能通过调节JNK 通路产生诱导成骨的作用。为此，本研究基于JNK 通路研究A-PRF 与β-TCP 复合物对兔股骨缺损区域的诱导成骨效果，为临床治疗骨缺损提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性新西兰大白兔24 只，5 ～6 月龄，体重（3±0.5）kg，购自成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（川）2020-030，使用许可证号：SYXK（川）2019-189。

1.2 试剂

A-PRF 由资阳市雁江区人民医院提供；β-TCP购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；兔碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）Elisa 试剂盒均购自上海茁彩生物科技有限公司；BMP-9、JNK、p-JNK抗体均购自艾博抗（上海）贸易有限公司。

1.3 仪器

Multiskan Sky 酶 标 仪、CX33 显 微 镜（ 日 本Olympus 公司）、电泳仪、凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4 主要实验方法

1.4.1 构建兔股骨缺损模型与给药处理[6]将动物分为模型组、1:1 复合物组（A-PRF:β-TCP=1:1）、2:1 复合物组（A-PRF:β-TCP=2:1）与4:1 复合物组（A-PRF:β-TCP=4:1）四组，每组各6 只。各组动物均静脉注射3% 戊巴比妥钠溶液（1 mL/kg）进行麻醉，在后肢膝关节外侧距前缘1.0cm 处做一弧形切口，长度约为5cm。暴露股骨外侧髁后，用骨钻制备直径为6 mm、深约8 mm 的圆柱形骨缺损区域，同时在距离骨缺损中央约6 mm 处，左右对称旋入1 枚直径为2 mm的钛钉进行定位。复合物组在骨缺损区域填充0.5 mL复合物，模型组不进行填充。各组动物均使用医用胶原修复膜覆盖切口处，之后每天肌内注射80 万U 青霉素钠进行抗感染治疗，持续3d。8 周后处死动物采集指标进行后续检测。

1.4.2 大致观察 术后观察各组动物切口愈合的状况，有无感染发生及饮食、活动状况；术后8 周肉眼观察骨缺损处的修复效果。

1.4.3 病理学检测 采集各组动物股骨缺损区域组织，用4% 多聚甲醛固定24 h，脱钙、脱水后制成石蜡切片，采用苏木精- 伊红（HE）染色法对切片进行染色，观察骨缺损区域的愈合情况与新生血管的形成情况。

1.4.4 酶联免疫吸附（Elisa） 检测采集各组动物血液，分离血清，按照免疫酶联试剂盒说明书对样本进行检测操作，检测兔血清中ALP 和OCN 的含量。

1.4.5 蛋白质免疫印迹（WesternBlot） 检测将收集的各组动物股骨组织置于液氮中研磨，进行蛋白质提取与定量，依次进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显影处理，最后使用凝胶成像系统对条带进行分析，计算蛋白质的表达水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同比例的APRF 与β-TCP 复合物对兔股骨缺损的修复效果

肉眼观察发现，模型组股骨缺损处修复尚未完全，2:1 复合物组缺损区域基本恢复，效果最佳，其次为4:1 复合物组与1:1 复合物组。HE 染色发现，模型组骨组织损伤区域明显，纤维组织增生情况严重，细胞核呈长梭形，炎性细胞浸润数量多，新生毛细血管形成数量少；1:1 复合物组骨组织损伤区域明显，植入材料分布明显，组织与材料之间出现少量纤维组织，炎性细胞浸润数量较多，淋巴细胞和中性粒细胞少量聚集，新生毛细血管形成数量少；2:1 复合物组骨组织之间损伤区域基本消失，可见少量植入材料分布，材料与骨组织之间出现较多纤维组织，炎性细胞浸润数量较少，大多数为淋巴细胞，同时可见大量新生毛细血管形成；4:1 复合物组骨组织之间损伤区域较少，可见少量植入材料分布，材料与骨组织之间出现纤维组织，可见炎性细胞浸润，新生毛细血管形成数量较多。结果见图1。

图1 四组动物股骨缺损区域修复情况与病理学观察结果（HE 染色）

2.2 不同比例的APRF 与β-TCP 复合物对兔血清OCN 与ALP 的影响

Elisa 检测结果显示，与模型组相比，复合物组血清中ALP 与OCN 的含量均显著升高（P＜0.05），复合物比例为2:1 时升高幅度最大。结果见表1。

表1 四组动物血清中ALP 与OCN 含量的变化情况（± s）

表1 四组动物血清中ALP 与OCN 含量的变化情况（± s）

注：* 与模型组相比，P ＜0.05 ；** 与模型组相比，P ＜0.01。

组别 ALP OCN模型组（n=6） 28.43±2.88 10.46±0.81 1:1 复合物组（n=6） 47.83±5.58** 14.45±1.83**2:1 复合物组（n=6） 70.25±3.04** 21.55±2.99**4:1 复合物组（n=6） 61.93±2.55** 19.58±2.11**

2.3 不同比例的APRF 与β-TCP 复合物对兔新生骨组织中JNK 通路的影响

WesternBlot 检测结果显示，与模型组相比，复合物组新生骨组织中BMP-9 与p-JNK 蛋白的表达水平均显著升高（P＜0.05），其中2:1 复合物组BMP-9、p-JNK 蛋白表达水平变化最大，JNK 蛋白表达水平则无明显变化。结果见表2。

表2 四组动物新生骨组织中BMP-9、JNK 和p-JNK 蛋白的表达情况（± s）

表2 四组动物新生骨组织中BMP-9、JNK 和p-JNK 蛋白的表达情况（± s）

注：* 与模型组相比，P ＜0.05 ；** 与模型组相比，P ＜0.01。

组别 BMP-9 JNK p-JNK模型组（n=6） 1.000±0.012 1.000±0.059 1.000±0.020 1:1 复合物组（n=6） 1.375±0.068** 1.008±0.028** 1.409±0.066**2:1 复合物组（n=6） 1.934±0.106** 0.982±0.028** 2.488±0.047**4:1 复合物组（n=6） 1.563±0.044** 0.936±0.016** 1.775±0.029**

3 讨论

生物复合材料介导的骨再生技术是一种很有前景的骨再生治疗策略。我们的前期研究发现，A-PRF 与β-TCP 在促成骨中可发挥重要作用，但A-PRF 与β-TCP 复合物促进骨形成的潜在机制尚不清楚。本实验通过建立兔股骨缺损模型发现，A-PRF 与β-TCP复合物能通过激活JNK 通路、诱导BMP-9 蛋白表达，产生骨修复作用，当A-PRF 与β-TCP 构成比例为2:1 时诱导效果最明显。ALP 是常见的成骨分化标志物[7]，通过成骨细胞分泌，促进钙、磷沉积在骨骼中，其含量的高低可反映成骨细胞的成骨能力[8]。OCN 是成骨分化过程中最敏感的指标之一，一方面可以提高ALP 的活性并加速与之结合，促进成骨细胞的增殖与骨形成；另一方面，OCN 与钙离子结合对促进骨沉积和骨生长有积极作用[9]。有研究发现，OCN 的活性与成骨细胞分化和破骨细胞凋亡呈正相关[10-11]。因此，OCN 的高表达可增加骨基质，增强骨质。本研究发现，在骨缺损区域填充A-PRF 与β-TCP 复合物8 周后，新生骨组织中的ALP 与OCN 含量均显著上升，复合物比例为2:1 时效果最好，说明在该比例下的A-PRF 与β-TCP 复合物诱导骨形成的效果最佳。MAPK 家族主要有三个亚家族，即细胞外信号调节激酶（ERK）、JNK 和p38。多项研究表明JNK 信号通路在调控成骨分化中发挥关键作用，JNK 磷酸化参与了成骨过程，大麻素受体通过激活JNK 通路可增强牙周韧带干细胞的骨/ 牙本质分化能力[12]，褐藻多糖通过激活JNK 通路可诱导人间充质干细胞成骨分化[13]。在JNK 参与成骨分化的调控因素中，BMPs 的作用是至关重要的，BMP-9 被认为是最具成骨能力的BMP，比BMP-2 表现出更多的骨再生潜能。自BMP-9 被发现以来，因其比其他BMP 家族成员具有更高的促进骨形成的能力而受到广泛关注[14-15]。有研究通过比较发现，与其他BMP 相比，BMP-9 能更有效地增强ALP活性，诱导滑膜间充质干细胞成骨分化，导致ALP、Runt 相关转录因子2（Runx2）、OCN、骨桥蛋白（OPN）mRNA 和蛋白的表达水平升高[16]。本研究发现，A-PRF与β-TCP 复合物能诱导新生骨组织中显著增加JNK蛋白磷酸化水平，激活JNK 通路，从而增加BMP-9蛋白的表达，诱导成骨分化与骨形成。

综上所述，本研究证实A-PRF 与β-TCP 组成的复合物可通过激活JNK 信号通路促进股骨缺损区域成骨，这可能是该复合物促进成骨的机制之一，且构成比例为2:1 时效果最佳。但由于JNK 通路与BMP-9蛋白刺激的骨形成涉及许多信号通路，因此A-PRF与β-TCP 复合物在骨再生技术中所起的骨形成作用机制还有待于进一步研究与发掘。