益生菌对肉鸡脾脏发育及淋巴细胞增殖的影响

张利卫，白欣洁，刘冠慧，张 曼，王 军，彭永帅，李月勤，李 果，宋予震*

（1.河南牧业经济学院动物医药学院，河南郑州 450046；2.北京农业职业学院畜牧兽医系，北京 102442；3.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038）

在畜牧生产中，抗生素的使用受到了限制，为了提高畜禽生产性能和免疫功能，新型替抗产品得到了人们的广泛关注。益生菌能产生活性物质和抗菌物质，而这些产物在清除肠道致病菌，增强宿主肠道黏膜完整性等方面具有重要作用（Park等，2016；朱学泰，2007）。研究表明，复合益生菌制剂可以提高肉鸡免疫功能，改善肉鸡肠道菌群（谢文惠，2018；张曼等，2015）。付丽等（2015）研究表明，饲料中添加乳酸菌可以提高肉仔鸡血清抗体水平。李可等（2015）研究发现，饲粮添加丁酸梭菌、屎肠球菌等菌类可提高AA 肉仔鸡的免疫器官指数。另外，Wu 等（2010）发现，长双歧杆菌有助于提高巨噬细胞的吞噬能力。益生菌能对机体免疫器官的生长发育产生一定的刺激，从而提高机体免疫水平（唐志刚等，2010）。肉鸡免疫器官是机体实现免疫功能的组织者（郭欣怡等，2016）。研究表明，复合益生菌制剂能通过提高肉鸡免疫器官指数来提高肉鸡免疫功能（叶思霖等，2021；桂雪儿，2020）。但益生菌提高肉鸡免疫器官指数的作用机制尚不明确。因此，本试验研究益生菌对肉鸡脾脏组织发育和淋巴细胞增殖的影响，确定益生菌影响肉鸡脾脏免疫功能的作用途径，从而为养禽业合理使用益生菌提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 动物饲养及取材 试验将75 只1日龄雄性肉鸡随机分为A、B、C、D 和E 5 组，每组5 只，每组3 个重复。试验组A、B、C、D 组分别添加不同益生菌（益生菌具体成分和添加量如下表1示），E 为空白对照组，饲喂基础日粮。基础日粮组成及营养水平见表2。其中益生菌A、益生菌B 和益生菌D 是固态益生菌，与饲料混合添加，益生菌C 是液态益生菌，稀释于水中饮用。益生菌由河南金百合生物科技股份有限公司提供。自由饮水，自由采食。饲养至21 d 后处死，取其脾脏于福尔马林中固定。

表1 益生菌成分及添加剂量

表2 基础日粮组成及营养水平

1.2 石蜡切片制作 取出固定的脾脏组织进行脱水和石蜡包埋，制作5 µm 厚的石蜡切片。

1.3 HE 染色 HE 染色步骤：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，逐级酒精各3 min，苏木素6 min，1% 盐酸酒精10 s，自来水10 min，逐级酒精3 min，伊红1 min，95% 乙醇I 3 min、100% 乙醇3 min，二甲苯Ⅰ 3 min、二甲苯Ⅱ 3 min，中性树胶封片。

1.4 免疫组织化学染色 免疫组织化学染色步骤：二甲苯I 和II，各10 min，逐级酒精各3 min，修复液水浴18 min，温度 95℃。冷却至常温，0.01 mol PBS 漂洗3 次，每次5 min，3% 过氧化甲醇避光20～30 min。0.01 mol PBS 漂洗3 次，每次5 min，5% 山羊血清37℃ 30 min，PCNA 一抗（1 ∶4000）4℃冰箱过夜，室温40 min，0.01 mol PBS 漂洗3 次，每次5 min。生物素标记的二抗（羊抗兔IgG，1 ∶300），室温2 h，PBS 漂洗3 次，每次5 min。滴加SABC 复合物，室温2 h，PBS漂洗3 次，每次5 min。DAB 显色液显色，蒸馏水5 min，苏木精染色液10 s。分色1.5 s，自来水冲洗10 min，蒸馏水3 min，逐级酒精各3 min，二甲苯I、二甲苯II 各5 min，中性树胶封片。

1.5 数据统计分析 将HE 染色切片和免疫组织化学染色切片用生物显微镜进行观察并拍照，用软件ImageJ 统计各组脾小结面积、PCNA 免疫阳性细胞光密度和阳性细胞数量。各组数据用SPSS 26 进行显著性分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 肉鸡脾小结面积大小 由表3和图1可知，A、B、C、D 组的脾小结面积比对照组分别增加30%（P＞0.05）、35.8%（P＞0.05）、60.97%（P＜0.05）和51.94%（P＜0.05）。这表明添加益生菌能促进肉鸡脾脏、脾小结生长。

表3 21日龄肉鸡脾脏PCNA 阳性细胞数量

表3 21日龄肉鸡脾小结面积

2.2 肉鸡脾脏PCNA 免疫阳性细胞数量 由表4和图2可知，A、B、C、D 组脾脏PCNA 免疫阳性细胞数量比对照组免疫阳性细胞数量分别增加46.61%（P＜0.05）、35.55%（P＜0.05）、27.35%（P＜0.05）和38.67%（P＜0.05）。这表明添加不同益生菌均能显著增加脾脏PCNA 阳性细胞数量。

2.3 肉鸡脾脏PCNA 免疫阳性细胞光密度 由表5和图2可知，A、B、C、D 组脾脏PCNA 免疫阳性细胞光密度比对照组免疫阳性细胞光密度分别显著增加11.74%（P＜0.05）、12.52%（P＜0.05）、9.04%（P＜0.05）和8.57%（P＜0.05），表明添加不同益生菌能提高肉鸡脾脏PCNA 免疫阳性细胞光密度。

表5 21日龄肉鸡脾脏PCNA 阳性细胞光密度

3 讨论

益生菌是一种微生态制剂，具有绿色、安全、无污染等优点。益生菌在肉鸡生长性能和免疫强度提高方面发挥着重要作用。于明等（2021）研究表明，饲料中添加复合益生菌制剂能提高肉鸡料重比，提高血清中IgA 和IgG 水平，增加盲肠有益菌群数量，从而提高肉鸡免疫功能。李桂杰等（2000）研究表明，加酶益生素能明显促进肉仔鸡生长，提高饲料转化率。

张利环等（2021）研究发现，益生菌能增强消化酶的分泌和活性，益生菌可以改善消化道形态，调节细胞膜GLUT2 过表达，促进营养物质转运，从而提高肉鸡生长性能。同样，刘凤美等（2018）研究发现，益生菌能提高肉鸡生产性能、胸腺、脾脏和法氏囊指数，改善肉鸡免疫抗病能力。本试验也发现益生菌能通过增加脾小结的面积来促进脾脏发育。

益生菌可能通过促进免疫器官、淋巴细胞的增殖来提高肉鸡的免疫功能。韩亚楠等（2021）发现，益生菌可以增强肉鸡法氏囊的免疫功能，从而提高肉鸡免疫力。本试验结果表明，添加不同益生菌均能提高脾脏增殖淋巴细胞的数量和光密度，表明益生菌能提高免疫器官淋巴细胞的增殖。

4 结论

本试验发现，与对照组相比，试验组脾脏免疫阳性细胞数量和免疫阳性细胞光密度具有显著差异，表明益生菌对肉鸡脾脏发育和脾脏内淋巴细胞增殖具有一定的促进作用。