基于Nrf2/Keap1信号通路研究黄芩甲苷对糖尿病肾病模型小鼠肾损伤的作用*

2022-12-15 13:03彭福梅尹青桥李相友
中医学报 2022年12期
关键词:甲苷系膜高糖

彭福梅,尹青桥,李相友

武汉市第三医院,湖北 武汉 430060

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)属于糖尿病常见并发症,随疾病发展极易导致慢性肾衰竭,威胁患者生命安全[1]。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ech-associated protein 1,Keap1)可在生理状态下与核转录因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)发生耦联,当机体发生病理性改变时,Keap1水平也会发生相应变化[2]。Nrf2参与细胞氧化还原平衡调节,已有报道指出,激活Nrf2可有效治疗DN导致的肾损伤[3]。研究指出,Keap1可被Nrf2激活,进而影响miR-142表达[4]。黄芩甲苷为中药黄芩中提取的有效成分,具有抗氧化、消炎、抑菌等作用[5]。本次研究通过分析黄芩甲苷对糖尿病小鼠肾损伤以及小鼠肾小球系膜细胞的影响,探究Nrf2/Keap1信号通路在黄芩甲苷治疗DN肾损伤中的作用。

1 材料

1.1 实验动物与细胞60只SPF级雌性C57BL/6小鼠,购买于南京军科生物工程有限公司,8~10周龄,体质量25~30 g,饲养在室温23 ℃、12 h/12 h光暗周期条件下,自由饮水采食,饲养1周后用于实验。小鼠肾小球系膜细胞系(SV40-Mes-13)由中国科学院生物化学与细胞生物学研究所提供,选择DMEM培养基进行细胞培养,温度37 ℃,二氧化碳体积分数5%。

1.2 药物与试剂RPMI 1640培养基(美国Invitrogen公司,批号:20200516);2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(butyleyanoacrylate,BCA)蛋白分析试剂盒(福州飞净生物科技有限公司,批号:20200317);细胞溶解缓冲液(武汉纯度生物科技有限公司,批号:20200412);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力测定试剂盒(德国Qiagen公司,批号:20190921);小鼠单克隆Nrf2抗体、Keap1抗体、血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)抗体(美国Abcam 公司,货号:ab89443、ab89563、ab89652);RNA提取试剂盒(广州双螺旋基因技术有限公司,批号:200423);反转录试剂盒(上海科博瑞生物科技有限公司,批号:210214);对照组病毒(LV-control)、过表达Keap1慢病毒(LV-Keap1)购于擎科生物科技有限公司;miR-142 mimic、miR-142 inhibitor、si-Keap1、pcDNA-Keap1及对照物pre-NC、NC、si-control、pcDNA购自吉玛基因公司。

1.3 仪器二氧化碳培养箱(型号:Herocell 180,上海力申仪器公司);倒置显微镜(型号:BX43,日本Olympus公司);单道手动移液器(型号:Reference®2,德国艾本德公司);电泳槽(型号:TY-80,南京普阳科学仪器研究所);低温离心机(型号:KL05R,湖南凯达科学仪器有限公司);酶标仪(型号:CA-2000,寰熙医疗器械有限公司);凝胶成像系统(型号:BioDoc-It,美国Analytik Jena US LLC公司)。

2 方法

2.1 动物分组、模型制备与给药60只C57BL/6小鼠中随机选择20只,分为对照组、正常+黄芩甲苷组,每组10只,其余40只小鼠制备糖尿病模型,具体如下:小鼠禁食12 h后,以150 mg·kg-1剂量腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)溶液,72 h后断尾取血,检测血糖水平,当小鼠空腹血糖>16.17 mol·L-1表示糖尿病小鼠模型诱导成功。采用高脂饲料喂养糖尿病模型小鼠30 d,当小鼠的24 h尿蛋白增加10倍以上,且空腹血糖>16.17 mol·L-1表示DN小鼠模型建立成功。将建模成功的小鼠随机分为DN组、DN+黄芩甲苷组、DN+ LV-Keap1组、DN+LV-control组,每组10只,对照组和DN组小鼠给予生理盐水灌胃;正常+黄芩甲苷组、DN+黄芩甲苷组小鼠灌胃给予10 g·L-1黄芩甲苷溶液,DN+ LV-Keap1组、DN+LV-control组先尾静脉注射0.5 mL LV-Keap1与LV-control,再给予10 g·L-1黄芩甲苷溶液灌胃,给药体积为10 mL·kg-1,每天2次,持续干预10周。

2.2 细胞分组及处理取冻存细胞,解冻后将其接种于含有10% 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1% 双抗的DMEM 培养基中,37 ℃、5%CO2条件下培养。取传代培养后细胞经含25 mmol·L-1葡萄糖的高糖培养基培养后,分为10组,分别为①葡萄糖+NC组(细胞高糖培养后转染NC);②葡萄糖+miR-142 inhibitor组(细胞高糖培养后转染miR-142 inhibitor以抑制miR-142表达);③葡萄糖+miR-142 inhibitor+si-control组(细胞高糖培养后进行miR-142 inhibitor和si-control共转染);④葡萄糖+miR-142 inhibitor+si-Keap1组[细胞高糖培养后进行miR-142 inhibitor和si-Keap1(抑制Keap1表达)共转染];⑤葡萄糖组(细胞仅进行高糖培养);⑥葡萄糖+黄芩甲苷组(细胞进行高糖培养后给予100 μmol·L-1黄芩甲苷干预);⑦葡萄糖+黄芩甲苷+pre-NC组(细胞进行高糖培养后给予100 μmol·L-1黄芩甲苷干预并转染pre-NC);⑧葡萄糖+黄芩甲苷+miR-142 mimic组(细胞进行高糖培养后给予100 μmol·L-1黄芩甲苷干预并转染miR-142 mimic使miR-142过表达);⑨葡萄糖+黄芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA组(细胞进行高糖培养后给予100 μmol·L-1黄芩甲苷干预并共转染miR-142 mimic和pcDNA);⑩葡萄糖+黄芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA-Keap1组[细胞进行高糖培养后给予100 μmol·L-1黄芩甲苷干预并共转染miR-142 mimic和pcDNA-Keap1(过表达Keap1)]。

2.3 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性检测实验结束后,取细胞培养上清液,采用SOD检测试剂盒检测细胞培养上清液中SOD的活性,操作过程严格按照试剂盒说明进行。

2.4 Western Blot检测小鼠肾组织及细胞中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达水平取处理后的细胞及肾组织,肾组织研磨后加裂解液,细胞直接加裂解液,12 000 r·min-1离心5 min,分离上清用于蛋白测定,经蛋白定量、电泳、转膜后进行免疫反应,依次加入一抗、二抗,反应结束后进行显色曝光,对目的条带的灰度值进行分析,并根据测定结果计算目的蛋白Nrf2、Keap1、HO-1的相对表达量,内参选择β-actin。

2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡根据凋亡检测试剂盒说明进行细胞凋亡检测,取对数生长期细胞,1 000 r·min-1离心5 min,获得目的细胞,PBS冲洗后再次离心,PBS重悬,乙醇固定,400目筛网过滤1次,1 000 r·min-1离心5 min,加1.0 mL PI染液,4 ℃ 避光30 min,加AnnexinV-FITC避光染色5 min,采用Facsverse流式细胞仪进行上机检测,每组设置复孔3个,通过荧光激活细胞分选仪检测细胞凋亡水平。

2.6 RT-qPCR检测miR-142mRNA的表达取小鼠肾组织灭菌后进行组织研磨,加入裂解液处理,12 000 r·min-1离心5 min,取上清。使用RNA提取试剂盒进行总RNA提取,操作过程严格按照RNA提取试剂盒说明进行操作,随后使用反转录试剂盒进行反转录,根据本次实验所需基因序列测定结果,选择保守序列区作为扩增区域,利用Primer5.0引物设计软件和BLAST软件程序设计出特异性扩增引物,获得cDNA。PCR扩增反应条件,95 ℃反应15 min,95 ℃反应10 s,60 ℃反应30 s,进行40个循环,绘制标准曲线,定量分析miR-142mRNA的相对表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

3 结果

3.1 黄芩甲苷对DN小鼠肾组织中miR-142mRNA及Keap1、Nrf2蛋白表达水平的影响与对照组比较,DN组miR-142mRNA表达水平显著升高(P<0.05),Keap1、Nrf2蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与DN组比较,DN+黄芩甲苷组miR-142mRNA表达水平显著降低(P<0.05),Keap1、Nrf2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图1。

注:A:miR-142 mRNA表达水平比较;B:Keap1、Nrf2蛋白表达水平比较;C:Keap1、Nrf2蛋白表达条带图;与对照组比较,*P<0.05;与DN组比较,#P<0.05图1 黄芩甲苷对DN小鼠肾组织中miR-142 mRNA及Keap1、Nrf2蛋白表达水平的影响

3.2 黄芩甲苷对过表达Keap1的DN小鼠肾组织中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达水平的影响与DN+LV-control组比较,DN+LV-Keap1组小鼠肾组织Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图2。

注:A:Keap1、Nrf2、HO-1蛋白条带图;B:Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达水平比较;与DN+LV-control组比较,aP<0.05图2 黄芩甲苷对过表达Keap1的DN小鼠肾组织Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达水平的影响

3.3 抑制miR-142表达对肾小球系膜细胞的影响与葡萄糖+NC组比较,葡萄糖+miR-142 inhibitor组细胞中Keap1、Nrf2蛋白表达水平及SOD水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡水平显著降低(P<0.05);与葡萄糖+miR-142 inhibitor组比较,葡萄糖+miR-142 inhibitor+si-Keap1组细胞中Keap1、Nrf2蛋白表达水平及SOD水平显著降低(P<0.05),细胞凋亡水平显著升高(P<0.05)。见图3。

注:与葡萄糖+NC组比较,*P<0.05;与葡糖糖+miR-142 inhibitor组比较,#P<0.05;A:肾小球系膜细胞Keap1、Nrf2蛋白表达条带图;B:Keap1、Nrf2蛋白表达水平比较;C:化学比色法检测SOD水平;D:流式细胞仪检测细胞凋亡图3 抑制miR-142表达对肾小球系膜细胞的影响

3.4 黄芩甲苷对肾小球系膜细胞的影响与葡萄糖组比较,葡萄糖+黄芩甲苷组Keap1、Nrf2蛋白及SOD水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与葡萄糖+黄芩甲苷+pre-NC组比较,葡萄糖+黄芩甲苷+miR-142 mimic组Keap1、Nrf2蛋白及SOD水平显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05),与葡萄糖+黄芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA组比较,葡萄糖+黄芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA-Keap1组Keap1、Nrf2蛋白及SOD水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见图4。

注:与葡萄糖组比较,*P<0.05;与葡萄糖+黄芩甲苷+pre-NC组比较,#P<0.05;与葡萄糖+黄芩甲苷+miR-142 mimic+pcDNA比较,&P<0.05;A:Nrf2、Keap1蛋白条带图;B:Nrf2、Keap1蛋白相对表达量;C:SOD水平比较;D:细胞凋亡率比较图4 黄芩甲苷对肾小球系膜细胞的影响结果

4 讨论

DN属于糖尿病常见并发症,是造成糖尿病患者死亡的主要并发症之一[6]。本次研究通过构建DN模型发现DN小鼠存在miR-142表达升高情况。糖尿病属“消渴”范畴,气阴两虚为该病主要病机,气能行血,血无气衰,则血行瘀滞,瘀血不仅作为病理产物,更是致病因素,进而引发一系列血管并发症,其中就包含糖尿病肾病[7]。肾小球具有丰富的毛细血管,回旋迂曲且细长,极易发生损伤,与中医所述脉络特征类似。已有大量研究证实,中医血瘀与炎症反应、氧化应激反应之间存在密切联系,而Nrf2/Keap1信号通路参与机体炎症反应及氧化过程,因此选取该信号通路作为本次的研究方向,探究其干预机制[8]。

黄芩是临床上常用的清热燥湿药,《神农本草经》记载:“黄芩,味苦平,主诸热黄疽,肠澼,泄利,逐水,下血闭,恶创恒蚀,火疡。”黄芩以根入药,具有清热燥湿、泻火解毒、安胎、止血等功效。现代研究表明,黄芩具有黄酮类、皂苷类、多糖类等多种活性成分,具有抗炎、抗肿瘤、抗心血管疾病及抗病毒等作用[9]。黄芩甲苷是中草药黄芩的主要有效成分,可有效上调Keap1蛋白表达,从而对H2O2诱导的细胞凋亡产生抑制作用[10]。有学者展开动物研究发现,黄芩甲苷可抑制DN动物肾组织细胞凋亡,降低肾脏损伤,使肾脏抗氧化能力增强,抑制DN进展[11],且黄芩甲苷可激活Nrf2,对多种疾病导致的组织损伤起到抑制作用[12-15]。本次研究基于Nrf2/Keap1通路探讨黄芩甲苷对于DN小鼠的影响。

在细胞增殖、分化、生长以及凋亡过程中均有成熟miRNA参与,miR-142是近几年医学研究的热门,多数学者认为其参与肿瘤发生及发展,是导致病变组织纤维化的重要因素[16-17]。研究指出,miR-142与肾纤维化发生发展存在密切联系[18]。本次研究通过分析肾组织中miR-142表达水平进一步证实DN小鼠肾组织中存在miR-142表达水平升高的情况,但经黄芩甲苷干预后其表达降低。研究指出,激活Nrf2可缓解DN造成的肾脏损伤[19-20],因此,可通过靶向激活Nrf2的方式缓解糖尿病引起的肾脏损伤[21]。本次研究对小鼠进行黄芩甲苷干预后显示,黄芩甲苷可有效上调小鼠肾组织中Nrf2表达。Keap1可在生理状态下与Nrf2发生耦联,广泛存在于机体各种细胞中[22-23]。研究证实,Keap1可通过促进高糖环境下肾脏细胞能量稳态重建的方式干预DN造成的肾组织损伤,从而抑制肾脏损伤,降低细胞凋亡率[24]。本次研究对小鼠肾脏组织中Keap1表达情况进行分析显示,黄芩甲苷可有效升高肾组织中Keap1的表达水平,并且注射过表达Keap1慢病毒后,HO-1表达升高,进一步证实Keap1在DN发生发展中的肾保护作用,可能是黄芩甲苷对DN小鼠Nrf2/Keap1通路产生影响,从而抑制miR-142表达,该结果与已有报道一致[25-26]。

本次研究选取高糖培养的肾小球系膜细胞系进行体外研究,结果显示,肾小球系膜细胞在转染 miR-142inhibitor后,Nrf2、Keap1蛋白表达升高,在对SOD及细胞凋亡情况进行分析时发现,细胞凋亡率明显降低,而SOD水平升高,而共转染si-Keap1细胞出现miR-142inhibitor转染作用逆转情况,Nrf2、Keap1蛋白表达降低,细胞凋亡升高,SOD降低,提示miR-142inhibitor转染所产生的保护作用可被 si-Keap1逆转。SOD是评估机体氧化反应情况的重要指标,被称为氧自由基杀手,可有效清除机体氧自由基[27],而氧自由基是造成组织损伤的关键因素[16]。本次研究结果显示,通过提高SOD水平降低氧化应激损伤的发生,激活Nrf2/Keap1信号通路抑制miR-142表达,进而对肾脏起到保护效果[28]。通过动物研究发现,黄芩甲苷可降低DN小鼠肾脏组织中miR-142表达,因此本次研究在细胞体外研究时同样进行黄芩甲苷干预,结果显示,黄芩甲苷可逆转高糖培养的肾小球系膜细胞损伤,升高Nrf2、Keap1蛋白表达,降低细胞凋亡率,增加SOD水平。进一步分析发现,过表达miR-142可逆转黄芩甲苷所产生的细胞保护作用,共表达Keap1、miR-142时,过表达Keap1使miR-142 mimic对细胞产生的影响再次被逆转。通过以上研究数据可以看出,黄芩甲苷对于高血糖导致的肾脏损伤可以起到保护作用,而且该作用是通过抑制miR-142表达并激活Nrf2/Keap1信号通路完成的。

综上所述,糖尿病肾病存在miR-142过表达情况,从而抑制Nrf2/Keap1通路激活,黄芩甲苷可逆转miR-142对Nrf2/Keap1信号通路的抑制作用,提高Keap1、Nrf2表达,进而达到改善糖尿病肾病的目的。

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