基于生物信息与网络药理学探讨人参治疗冠心病的分子机制*

葛亚如，王承龙

中国中医科学院西苑医院/国家中医心血管病临床医学研究中心，北京 100091

冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)又称缺血性心脏病，是指冠状动脉粥样硬化形成粥样斑块，导致血管管腔狭窄甚至阻塞，引起心肌缺血缺氧或坏死而形成的心脏病，是临床常见的慢性心血管疾病。其发病因素与高血压、高胆固醇血症、糖尿病、肥胖及遗传因素等有关，常用的治疗手段包括血运重建、二级预防药物治疗[1]。人参为五加科植物人参的干燥根，《神农本草经》载“人参，味甘，微寒。主补五脏，安精神，定惊悸……[2]”张锡纯谓其：“人参补气之力，实倍于补血……[3]”故将人参的功效总结为补益气血。现代药理研究发现，人参的活性成分主要有皂苷类、多糖类、有机酸和蛋白质等[4-5]。研究发现，人参皂苷Rb3能明显降低大鼠心肌梗死不同阶段血清肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白细胞介素(interleukin，IL)-1β及转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1的水平，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[6]。人参皂苷Rb1可激活人体主动脉内皮细胞中磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphoinositide-3-kinase-alkaline protein kinases，PI3K-Akt)、丝裂原活化蛋白质激酶的激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-activated protein kinase kinase /extracellular signal-regulated protein kinase，MEK/ERK)信号通路，引起内皮型一氧化氮合酶(endothelial-type nitric oxide synthase，eNOS)磷酸化，增加一氧化氮(nitrogen monoxide，NO)释放[7]。人参多糖能显著降低冠心病大鼠的死亡因子(factor associated suicide，Fas)、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)表达水平，具有抗氧化、保护心肌线粒体的作用[8]。但上述研究都是通过基础研究或查阅文献发现可能的靶点和通路，难以体现中药治疗疾病多靶点、多通路的特点，故需要通过大数据挖掘人参与冠心病之间的靶点通路。

本文通过生物信息学与网络药理学技术方法，筛选人参治疗冠心病潜在的靶点和通路，为后续中药的研发和临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 资料库及研究流程正文所涉及的资料库见表1，研究流程见图1。

表1 人参治疗冠心病作用靶点筛选所用数据库基本信息

图1 人参治疗冠心病的分子机制研究流程图

1.2 人参化学成分及靶点筛选使用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[9]搜索人参的主要化学成分，建立人参化合物数据库。根据TCMSP 数据库中药物动力学(absorption and distribution and metabolismand excretion，ADME) 参数，构建包括口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、药物类药性(drug-likeness，DL)在内的综合模型以此来筛选潜在活性化合物，以OB≥30%和DL≥0.18作为阈值筛选化合物。

然后将在TCMSP数据库中获取的化合物的潜在靶点上传至UniProt数据库进行靶点注释[10]，限定物种为人，获得蛋白靶点对应的基因信息并导入Cytoscape 3.8.2构建“中药-化合物-靶点”网络图。

1.3 冠心病疾病靶点筛选以“coronary heart disease” 为关键词，通过筛选OMIM、Drugbank、GeneCards、TTD、DisGeNET疾病数据库[11-14]，合并去重后获得冠心病相关靶点，并利用Uniprot 数据库获得冠心病靶点的Uniprot ID，以备后续统计分析。

1.4 人参-冠心病共同靶点获取将化合物靶点与疾病靶点取交集，利用R程序绘制韦恩图，获取人参治疗冠心病的共同靶点，并导入Cytoscape 3.8.2构建“人参-共同靶点-冠心病”网络以备后续分析。

1.5 关键共同靶点筛选及分析将药物-疾病共同靶点输入STRING数据库[15]，选取minimumrequired interaction score>0.9，构建蛋白质相互作用(proteinproteininteraction，PPI)网络图，将结果保存成tsv文件，使用Cytoscape软件构建PPI网络，借助Cytoscape的工具分析包计算网络中节点的拓扑学属性，根据度值(Degree)、间距中心度(betweeness centrality，BC)及紧密中心度(closeness centrality，CC)等参数筛选出关键共有靶点网络及核心靶点，其中设置Degree值大于2倍中位数的为关键靶点，构建PPI网络。

1.6 富集分析基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路富集分析，将药物与疾病的关键共同靶点上传至DAVID平台，参数设置为Hspecies，即可获取GO功能富集分析中的分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和KEGG信号通路富集分析结果，以P<0.05为富集分析结果有统计学意义，利用R软件将结果以气泡图形式输出。

1.7 构建人参-共同靶点-通路网络图对1.5中获得的药物-疾病共同靶点以及1.6中获得的通路名称，制作network.xlsx和type.xlsx文件，导入Cytoscape软件，利用Network Analyzer工具包计算网络中节点的拓扑属性，然后根据Degree值设置药物、靶点以及通路大小，菱形表示人参，椭圆形表示靶点，矩形表示通路，构建人参-共同靶点-通路网络图。

1.8 关键化合物与核心靶点的分子对接为观察人参进入机体后，能否和机体的靶蛋白结合从而发挥药效，将人参的关键化合物与筛选出的7个关键核心靶点进行分子对接。首先从PubChem数据库[16]下载人参化合物的2D结构，保存成SDF格式，然后利用软件ChemBio3D对化合物结构进行优化，保存成Mol2格式。在PDB数据库检索靶基因蛋白构象[17]，并根据以下条件进行筛选：①通过X晶体衍射法获取的蛋白结构；②蛋白的晶体解析度<2.5 A；③分型明确的蛋白。利用IGEMDOCK软件进行关键化合物与核心靶点的分子对接，得到分子对接数据[18]。使用PyMOL软件对化合物与蛋白的相互作用进行绘制[19]。

1.9 观察指标主要包括筛选的基因靶点及相关通路。

2 结果

2.1 人参化学成分筛选及靶点获取根据设置的筛选条件，以“Homosapiens”为检索物种，共检索到17种中药有效成分(见表2)，去除重复靶点并通过Uniprot数据库中已经筛选出的靶蛋白进行标准化注释，最终获得111个药物作用靶点。通过TCMSP筛选中药化学成分并获取靶点后，导入Cytoscape 3.8.2 软件构建人参成分-靶点相互作用网络图(见图2)，其中绿色圆形节点代表人参活性化合物(RSn)，蓝色菱形节点代表人参作用靶点，连线代表化合物与靶点的相互作用关系。

注：绿色节点代表人参活性化合物；蓝色节点代表预测靶点图2 人参成分-靶点相互作用网络图

表2 人参化合物信息

2.2 人参-冠心病靶点韦恩图分析将获取的中药靶点与目标疾病相关联的靶点进行韦恩图叠加分析，可以快速得到药物与疾病相互作用的目标靶点。通过筛选上述疾病数据库合并去重后共获得冠心病相关靶点1 886个，人参预测获得的靶点111个，利用R程序包绘制人参预测靶点与冠心病靶点韦恩图，得到58个共同靶点，见图3。

注：Disease表示冠心病，Drug表示人参，两圆重合部分表示58个共同靶点图3 药物-疾病共同靶点韦恩图

2.3 关键共同靶点筛选通过Cytoscape中BisoGenet软件绘制共同靶点间的相互作用网络并进行拓扑分析，选取Degree≥二倍中位数，BC及CC大于中位数逐次筛选出关键共同核心靶点，共涉及175个节点(node)和3 406条边(edge)，见图4。

图4 人参-冠心病关键靶点网络图

2.4 人参治疗冠心病共同靶点的PPI网络分析构建药物治疗目标疾病的潜在靶点PPI网络有助于更系统地研究疾病分子机制，更直观地了解药物与疾病之间潜在靶点的关联。将上述获得的58个药物-疾病共同靶点输入STRING数据库，构建人参治疗冠心病共同靶点的PPI网络(图5)。网络中共有58个节点和425条边。通过Network Analyzer工具包分析，选取Degree≥二倍中位数，得到7个关键共有靶点和21条边。关键靶点间的详细信息见表3。

注：菱形红色节点表示Degree≥28的靶点，其他圆形蓝色节点表示Degree<28的靶点，节点越大代表该节点在网络中越重要。AKT1为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，TNF为肿瘤坏死因子，PTGS2为前列腺素内过氧化物合酶2，IL-1β为白细胞介素1b，CASP3为半胱天冬酶，JUN为JUN原癌基因，NOS3为一氧化氮合酶3图5 人参治疗冠心病的PPI网络图

表3 人参治疗冠心病的关键靶点信息

2.5 GO功能、KEGG信号通路富集分析将58个共同靶点导入DAVID平台进行GO功能、KEGG功能富集分析，分别得到416个GO功能、富集分析条目及97个KEGG信号通路富集分析条目。MF富集结果共包含61个条目，主要涉及蛋白质结合、酶结合、受体结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活序列特异性DNA结合、血红素结合等方面。BP富集结果共有299个条目，主要涉及调控转录、凋亡过程、信号转导、细胞增殖、炎症反应、氧化还原、血管生成等方面。CC富集结果共有35个条目，主要涉及内质网、质膜、细胞溶质、细胞质等方面。根据P值大小(P<0.01)，用条形图分别列举了各类前10位的条目(图6)。

图6 GO功能富集分析

对KEGG信号通路富集分析结果中前20条通路进行可视化处理，见图7。图中气泡的大小表示该条目下基因的个数，气泡越大则基因数越多；颜色表示调整后的P值，颜色越红表示P值越小，富集结果越明显。根据Count值排序，大于中位数(6)的通路主要有TNF(12)、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)(10)、PI3K-Akt(9)、MAPK(8)、Toll样受体(8)及核蛋白因子-κB(Nucleoprotein factor-κB，NF-κB)(8)信号通路，其中TNF及cAMP信号通路更为重要，选择这些条路进行绘制，见图8、图9。

图7 KEGG信号通路富集分析

注：图中矩形框代表基因(蛋白质)，白色节点代表通路蛋白，红色代表人参的关键作用靶点，实线箭头代表激活，虚线箭头代表间接关系，两个箭头中间带圈的表示表达图8 KEGG-TNF信号通路

注：图中矩形框代表基因(蛋白质)，白色节点代表通路蛋白，红色代表人参的关键作用靶点，实线箭头代表激活，虚线箭头代表间接关系，两个箭头中间带圈的表示表达图9 KEGG-cAMP信号通路

2.6 构建人参-共同靶点-通路网络图筛选KEGG信号通路条目中Count值>中位数(6)的条目共37条，然后构建人参-共同靶点-通路网络图，见图10。网络中节点越大表明该节点越重要，该网络中共包含41个药物-疾病共同靶点、37条KEGG信号通路、79个节点和368条边。共同靶点根据Degree值进行排序，前10位的靶点分别是AKT1、TNF、PI3KCG、NF-κBIα、JUN、IL-1β、CASP3、TGF-β1、BCL2、CASP8。

注：黄色菱形表示人参，绿色椭圆形表示共同靶点，红色矩形表示通路。RS表示人参；AKT1为丝氨酸/苏氨酸激酶1；TNF为肿瘤坏死因子；PI3KCG为磷脂酰肌醇3-激酶；NF-κBIα为NF-κB 抑制剂α；JUN为JUN原癌基因；IL-1β为白细胞介素1β；CASP3半胱天冬酶3；TGF-β1为转化生长因子β1；BCL2为B细胞淋巴瘤2，是一种细胞凋亡调节因子；CASP8为半胱天冬酶8图10 人参-共同靶点-通路网络图

2.7 关键化合物与核心靶点的分子对接选取Degree值>中位数(10)的化合物共9个，与7个核心靶点进行分子对接。IGEMDOCK软件分子对接结果以能量高低来判断化合物与靶点的结合程度，能量值越低代表亲和力越大，具体对接结果信息见表4。ginsenoside rh2与PTGS2结合亲和力最强，对其进行可视化分析，见图11。

表4 关键化合物与核心靶点的分子对接 (kcl·mol-1)

图11 PTGS2与ginsenoside rh2的分子对接模式图

3 讨论

《中国心血管健康与疾病报告2020概要》指出，中国心血管患病率处于持续上升阶段，冠心病现患人数为1 139万，并且其发病趋势呈年轻化，给家庭及社会造成巨大的负担[1]。目前，冠心病的治疗药物主要以二级预防药物为主，如抗血小板药物、β受体阻滞剂、降血脂血压药物等。冠心病属中医“胸痹心痛”范畴。人参大补元气，主治气虚证、气虚血瘀证，已经被证实治疗冠心病有效，但有关人参治疗冠心病靶点和通路的研究有限，大部分通过前期试验或文献查阅所得，所以本文旨在通过网络药理学的方法探讨人参治疗冠心病的分子作用机制。

文章按照设置的筛选条件，共筛选出17个人参的有效成分，58个人参-疾病共同靶点，按Degree值筛选出7个关键共同靶点，主要与炎症、免疫及细胞增殖凋亡等相关，包括AKT1、TNF、PTGS2、IL-1β、CASP3、JUN、NOS3。

AKT1是3种密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2、AKT3)之一[20]，参与调节包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成等多种过程，是PI3K-Akt信号转导途径的重要中间分子，与动脉粥样硬化斑块形成有关，是心血管疾病的关键参与者[21-22]。TNF作为NF-κB通路的上游信号分子，可促进其他细胞因子和趋化因子的产生，加剧冠心病的慢性炎症反应，对于启动炎症-免疫应答、动员级联反应具有重要作用[23]。PTGS2亦称环加氧酶，负责参与炎症和有丝分裂的前列腺素的生物合成，其作用途径与催产素信号转导和免疫反应有关途径相关，参与调节细胞增殖和抑制细胞凋亡过程[24]。IL-1β是一种强效的促炎细胞因子，通过与TNF和IL-6协同诱导血管内皮生长因子产生，在血管生成中发挥作用。CASP3参与细胞凋亡、坏死和炎症的信号通路。NOS3是产生NO的一种合酶，PI3K-Akt-NOS通路的抑制会影响NO的释放，加剧血管收缩，加重冠状动脉粥样硬化斑块形成、缺血。冠心病患者的血管长期处于炎症状态，TNF、IL-1β等促炎因子升高，而促炎因子的过度释放会导致细胞毒性，损伤心血管内皮细胞结构和功能[25-26]。冠心病患者心肌细胞可能会出现坏死、凋亡等过程，导致功能性心肌细胞含量减少。文章中PPI网络发现，人参通过作用于CAPS3、BCL2等凋亡基因，抑制Caspase3表达及Bcl2/Bax比例从而减少心肌细胞凋亡，维持冠心病患者心肌细胞正常形态和功能。研究表明，在人体主动脉内皮细胞中，人参可激活PI3K-Akt信号通路，引起eNOS磷酸化，增加NO释放，并能减轻细胞脂质过氧化损伤；在人脐静脉内皮细胞中，人参可通过下调microRNA的表达，增加eNOS合成，促进细胞迁移及血管生成[27-28]。

GO功能富集分析结果显示，人参治疗冠心病的生物学进程主要集中在炎症反应、细胞增殖与凋亡。KEGG信号通路富集分析结果表明，疾病-药物共同靶点主要富集在TNF、cAMP、PI3K-Akt及MAPK信号通路。根据人参-共同靶点-通路网络图，在Cytoscape数据库中，利用“Ctrl+6”“Ctrl+N”快捷键，可以看出有12个靶点参与了TNF信号通路，其中有关键靶点AKT1、TNF；有10个靶点参与了cAMP信号通路，其中有关键靶点AKT1、JUN；有9个靶点参与了PI3K-Akt信号通路，其中关键靶点AKT1、NOS3参与了该过程；各有8个靶点参与了MAPK和Toll样受体信号通路，其中有靶点AKT1、TNF。从而可知，人参的重要靶点AKT1主要通过TNF、cAMP、MAPK、PI3K-Akt及Toll样受体信号通路发挥抗炎与抑制心肌细胞凋亡的作用。另外，TNF靶点有21条通路，在关键通路中与TNF、MAPK、Toll样受体和NF-κB信号通路有关；PIK3CG靶点有21条通路，在关键通路中与TNF、PI3K-Akt、cAMP、Toll样受体信号通路有关；NFKBIA靶点有18条通路，在关键通路中与TNF、NF-κB、cAMP和Toll样受体信号通路有关。

采用分子对接技术，将人参中的主要成分山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、富马酸(fumarine)、豆甾醇(stigmasterol)、山槐素(inermin)、吉九里香碱(girinimbin)、4-羟基苯甲酸(dianthramine)、花生苷酸(arachidonate)和人参皂苷Rh2(ginsenoside rh2)，与核心靶点AKT1、TNF、PTGS2、IL-1β、CASP3、JUN和NOS3进行结合能力测试，结果发现人参皂苷rh2与PTGS2结合能力最强。

综上所述，人参通过AKT1、TNF、PTGS2、IL-1β、CASP3、JUN、NOS3等关键靶点与TNF、cAMP、MAPK、PI3K-Akt、Toll样受体及NF-κB等多条主要信号通路发挥抗炎、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的方式治疗冠心病。网络药理学的应用为中药治疗疾病的研究提供了新的方法和技术，有助于更高效地预测相关靶点和通路，但是后续仍需体内或体外实验加以验证。