超声心动图评价小鼠主动脉弓缩窄模型心脏结构与功能

冯娇，刘楠楠

(1.锦州医科大学北部战区总医院研究生培养基地；2.北部战区总医院全军心血管病研究所，辽宁 沈阳 110016)

心力衰竭严重影响并危害居民健康，其诊疗工作仍是亟待解决的问题[1]。心力衰竭的临床前期研究仍然严重依赖于小鼠心力衰竭模型，实验性复制心力衰竭的动物模型有助于我们理解疾病所涉及的细胞和分子机制，在心力衰竭开发新的预防和治疗方法上发挥着重要作用[2]。心衰模型以不良的心脏重构过程为特征[3]，应用最广泛的是Rockman等人[4]描述的横向主动脉弓缩窄(TAC)模型。该模型在某种程度上模拟人类的高血压状态，出现左心室肥大及收缩或舒张功能不全，长期进展为心力衰竭[5]。心脏结构和功能的评估是验证试验模型成功与否的关键之一，自从引入小鼠超声心动图以来，大多数TAC模型的研究报告使用超声心动图记录心脏尺寸和功能[6]。

超声心动图可在镇静的动物身上快速进行[7]，为活体心功能评估提供了独特的手段，对实验室监测各种心脏模型、心脏结构与功能改变有重要应用价值[8]。二维B型显像用于检测心脏的异常运动或结构改变，一维M型显像用于量化心脏的大小和收缩力[9]。由于超声成像技术的进步，超声系统已经具备了获得精确可靠的小鼠心脏图像的能力，本实验主要通过高频超声心动图测量左心腔大小、左室壁厚度及收缩功能，并结合其他辅助检查对小鼠主动脉弓缩窄所引发的心衰模型做出综合评价。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SPF级C57BL/6J小鼠20只，8周龄，21～24克/只，订购于沈阳北部战区总医院科研基地[SCXK(辽)2020-0001]，适应性喂养于全军重症战创伤中心实验室[SYXK(辽)2020-0005]，1 w内自由活动与饮食。实验经医院动物护理委员会批准(2019-1008)。

1.2 制作实验动物模型

20只小鼠随机分为两组，假手术组(SHAM)6只，手术组(TAC)14只，手术前禁喂食物，随意饮水，进行主动脉弓缩窄术。如之前发表的文献[10-11]，TAC组创建主动脉弓缩窄模型，使用腹腔注射进行麻醉，将甲苯噻嗪(10 mg/kg)、氯胺酮(100 mg/kg)混于生理盐水，完全麻醉小鼠后，将其固定在小动物手术台上。对手术区域进行脱毛，使用碘伏进行消毒，在台式手术显微镜(镇江中天 XTS-4A)下操作，切开胸部皮肤，暴露胸骨，沿小鼠前正中线自胸骨上窝至胸骨角下剪开胸骨，通过开胸器撑开暴露胸腺。沿左右脂肪垫连接处拨开，暴露出主动脉胸段。游离主动脉弓，于下方穿入7-0丝线，将27G针头与主动脉弓平行放置，共同结扎。结扎后抽出细针观察小鼠情况，对比右侧无名动脉与左侧颈总动脉充血情况，然后用5-0丝线连续缝合胸骨与皮肤，涂抹适量消炎药。SHAM组开胸分离主动脉弓后用7-0丝线缠绕但不进行结扎。术后将小鼠放在保温垫上保温，苏醒后根据活动情况放回饲养笼内进行日常饲养。对两组小鼠进行生存分析，术后至模型建立后6 w内，每天检查笼内是否有动物死亡。

1.3 经胸超声心动图

从颈部到胸部剑突水平去除毛发以优化声学界面，用异氟醚麻醉小鼠(2%用于诱导，1.5%用于维持)，体温保持在36 ℃～37 ℃，在整个成像过程中监测心率和呼吸。使用高频超声探头进行经胸超声检查。术前1 d、术后1 w、术后6 w使用小动物超声仪和30 MHz线性阵列换能器(Vevo 2100 Imaging System，Serial Number：2100-0335)观察小鼠主动脉弓处血流情况，多个视图完成二维长轴、连续短轴视图和四腔心多普勒超声检查。避免在图像采集过程中胸部受到任何压缩和探头无倾向性倾斜，多普勒波束与流向截角控制在60°以内。采集反应心室结构的参数：左室舒张末期后壁厚度(LVPWd)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期容积(LVEDV)，左心室收缩末期容积(LVESV)，计算出反应左心室收缩功能的指标：射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)。

1.4 病理组织学分析

术后6 w超声检查后24 h，小鼠按照手术方法麻醉，颈椎脱臼进行安乐死，切除心脏并进行器官称重，计算心体比值(HW/BW)，取对照组3只、手术组6只，心脏组织进行切片，固定、脱水处理后，石蜡包埋，自然冷却后，病理切片机切成4 μm厚的病理切片，用苏木精和伊红染色，并在光镜下进行组织病理学分析。HE染色观察心肌细胞。通过马松染色对纤维化的情况进行观察，细胞核、纤维素、肌纤维显像为黑色，而胶原纤维显像成蓝色。使用Media Cybernetics的Image-Pro Plus 2D软件对图像胶原含量进行分析。

1.5 Western Blot检测蛋白质水平

另取对照组小鼠3只、手术组小鼠6只，整个心脏组织进行蛋白印迹检测，心脏研磨后加入组织裂解缓冲液中，于4 ℃、12 000×g离心15 min，使用BCA protein 测定试剂盒检测蛋白质的浓度。在10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶中分离等量的蛋白质样品，并转移到硝NC膜，再将NC膜用5%的脱脂牛奶密封2 h，然后在4 ℃下与ANP抗体(abcam，ab180649)孵育，隔夜后PBST冲洗，用对应的二级抗体(1∶1000)在室温下孵育90 min，PBST洗膜后用ECL发光液显影。密度分析使用ImageJ图像软件。

1.6 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。符合正态分布的数据用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，各组间比较采用重复测量方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠存活率

术后至术后6 w每天记录小鼠生存情况。手术组14只小鼠，2只在术后1 d死亡，假手术组小鼠无死亡，手术组小鼠存活率为85.7%。

2.2 高频超声心动图检测心脏结构与功能变化

小鼠各超声数值之间均存在交互效应，提示两组小鼠随着实验周数的延长，心脏结构与收缩功能变化情况不同；成对比较结果提示对照组小鼠各超声指标未随时间变化产生统计学意义，而手术组小鼠术后6 w与术前1 d、术后1 w时各超声指标比较有显著差异性；与对照组小鼠相比，术前1 d，两组小鼠各超声指标均无统计学意义，见表1；术后1 w时，TAC组小鼠左心室后壁厚度增加，左室大小及容积未见明显变化，左室短轴缩短率无明显变化，见表2；术后6 w时，TAC组小鼠左室舒张末期和收缩末期内径和容积增加，左室射血分数及短轴缩短率减少，左室后壁厚度变薄，但尚未产生统计学差异，见表3。两组小鼠不同时间段有代表性的M型超声，见图1。

表1 术前1 d小鼠左室形态结构与收缩功能参数

表2 术后1 w小鼠左室形态结构与收缩功能参数

表3 术后6 w小鼠左室形态结构与收缩功能参数

图1 有代表性的M型超声心动图

2.3 蛋白印迹法检测结果

术后6 w测量心肌组织中心肌肥大相关蛋白ANP水平，TAC组较SHAM组表达水平增强，见图2。

图2 两组小鼠心肌组织ANP蛋白表达水平

2.4 形态学及病理组织学改变

6 w时两组小鼠之间体重(BW)没有差异性，但是手术组小鼠心脏重量(HW)及心体比值(HW/BW)较对照组增加，见表4。HE染色显示，与对照组心肌细胞大小均匀、形态完整相比，手术组小鼠心肌细胞肥大，胞浆染色加深，并可见心肌细胞坏死。Masson染色显示，对照组心肌纤维排布整齐，手术组心肌纤维排布紊乱，并见大量间质胶原纤维，表明心肌细胞纤维化明显，见图3。

表4 两组小鼠术后6 w时心脏、体重、心体比值

A：术后6 w两组小鼠心肌HE染色；B：术后6 w两组小鼠心肌Masson染色图3 小鼠心肌组织病理学图像

3 讨 论

本研究通过外科方法建立主动脉弓缩窄模型，综合应用高频超声心动图及多种病理学方法，展示了小鼠TAC模型的病理发展进程，其表现为代偿性心肌肥厚到失代偿扩张型收缩期心衰的阶段特征，为日后小鼠主动脉弓缩窄模型的使用提供相关理论基础。术后1 w时小鼠出现心肌厚度增加但未出现心室扩张及收缩功能障碍，术后6 w时小鼠有显著的收缩功能减低，心肌组织肥大、坏死，纤维化明显，ANP蛋白表达增强。本实验结果提示TAC模型建模后成功率高、心功能减低理想，是一种良好的由后负荷增加导致的心衰模型。

实验中主动脉缩窄术后1 d有2只小鼠死亡，尸解后见肺充血，死亡原因可能为急性左心衰，其余小鼠至实验结束时未发生死亡，证明该模型稳定性良好，可广泛应用于压力负荷性心衰疾病过程中的研究。

术后1 w时，小鼠的心腔大小、体重及容积未发生明显变化，但已经出现左室壁心肌增厚，提示此阶段心脏表现为因后负荷增加所致的代偿性心肌肥厚。同时，射血分数、短轴缩短率作为左室收缩功能的主要指标，分别代表了左室排空功能和心肌缩短能力，并未发生明显统计学变化，但呈现出轻微的增强，考虑为收缩功能代偿性增加。有实验证明，TAC术后1 w就能出现左室肥厚[12]，而在术后2 w将会达到峰值[13]，与本实验结果相近。

术后6 w时，小鼠大体表现为HW/BW的比值增加。ANP蛋白能特异性反映心肌细胞肥大并提示存在早期心力衰竭，在压力超负荷法建立的模型中有较明显的优势[14]。术后6 w的小鼠心肌细胞ANP表达增强，组织染色见细胞坏死、心肌纤维紊乱，间质胶原纤维含量增多。此阶段超声测量的小鼠结构方面，心腔增大、心室壁变薄；在心功能方面，收缩功能代偿性增加的优势消失，左室壁运动普遍减弱，射血乏力，从代偿进入失代偿状态。以上结果均证明了术后6 w充血性心力衰竭的存在。

小鼠主动脉弓缩窄模型由于操作者手法及小鼠个体差异性，致使获得的实验模型心室肥厚与心衰出现的时间也各不相同[15]，模型广泛应用心衰发病机理及药物治疗的研究[16]，本实验验证了该模型早期表现出代偿性心肌增厚以适应后负荷增加，此阶段与人类高血压性心脏病相似。继续发展可出现左心室舒张末期压力增加，可能会造成舒张功能不全近年来舒张性心衰受到越来越多的关注，该模型的应用也得到了认可[17]。

心脏功能是临床和科学研究的关键指标。标准的左室M型超声心动图能够检测TAC小鼠的心脏收缩功能障碍。因尚无统一的标准界定小鼠心脏大小及收缩功能正常值，所以本实验以术前1 d小鼠数据为基数。小鼠的心脏大小因品系、性别和年龄而异，故对小鼠进行舒张功能评估的可行性必须谨慎[18]。小鼠心脏的心尖视图不易再现，频谱采样时二尖瓣血流方向与超声束不平行，缺乏可靠的角度校正法。更重要的是，小鼠心率快常伴随着二尖瓣E波和A波的融合。为了区分E波和A波，常需减慢心率，而通过麻醉剂减慢心率时对小鼠舒张功能是否有影响尚不清楚[19]，因而应使用多种方法综合评价左室舒张功能。王冠等[20]证实了左心房面积和IVRT的改变可能是小鼠充盈压升高和舒张功能不全的早期标志，而LVEDP升高可能提示舒张功能不全的晚期指标，重申了用多种方法测定小鼠心脏舒张功能的优势。本次实验以小鼠收缩功能指标为重点，尚未全面验证舒张功能指标。

随着最近的技术进步，新发布的超声系统提供了更高的图像分辨率和帧频率，以确保小动物的精准定量测量。新的超声心动图技术也将进一步增强超声成像系统评价心脏功能的敏感性。例如，斑点追踪应变成像已被用于精确测量局部心肌功能。目前正在开发的新传感器技术将为三维、四维成像提供更大的发展空间。

本实验结果表明，结扎主动脉弓后心脏发生一系列因压力负荷增加导致的心脏结构功能变化，模型可用于舒张与收缩功能障碍性疾病的进一步研究，超声心动图准确反应心脏结构功能变化特征，是一种相对简单和无创性的技术，可以在不影响血管通路的情况下评估小鼠的心脏结构细微变化，超声心动图将为研究小鼠各种心血管疾病模型的评估提供更大的帮助。