QuEChERS前处理技术在动物产品兽药残留检测中的运用分析

王生华，康 平，熊永莉，洪维晖，伍 君，彭桂萍，雷 彬

（荆门市农产品质量检验所，湖北 荆门 448000）

1 QuEChERS 前处理技术运用

QuEChERS 前处理技术是近年来在国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术，因简便、环保、低能耗、快速、安全可靠是当前样品前处理的发展趋势。样品前处理是指样品的制备、待测物的提取、净化及浓缩等一系列过程。目前，动物样品中兽药残留的前处理方法主要包括：基质固相分散萃取（MSPD）、分散固相萃取技术（DSPE）、固相萃取法（SPE）、液液萃取法（LLE）、固相微萃取（SPME）与 QuEChERS 萃取法等。这些方法所用有机溶剂量大，用检测人员和环境不太友好，我们想借助QuEChERS 前处理在农产品检测中的优势，实验用于动物样品的前处理，验证是否实现优化动物样品检测方法的目的。

2 QuEChERS 前处理技术步骤

QuEChERS 前处理技术主要分为酸化乙腈的液液萃取过程和基质分散固相萃取净化过程两个步骤。该方法的研究热点及难点是通过改进提取溶剂和净化填料的组分，以取得最佳的提取和净化效果。其主要步骤如图1。

图1

2.1 萃取过程

提取溶剂：为了准确地测定动物样品中残留兽药的含量，合适的提取溶剂的选择尤为关键。乙腈极性范围较宽，组织穿透能力较强，对蛋白质、脂肪类化合物的提取率很低，对多数目标化合物有较好的溶解性和较高的提取效率；乙酸乙酯的极性相对较弱，毒性较低，二者均是较为理想的提取溶剂，加入一定体积分数的甲酸或者乙酸可以破坏基质的组织结构，目标物质在酸性环境下较易从组织结构中游离出来。

除水剂：提取溶剂除了能将待测物提取出来，同时也能提样品中的水分，水分的存在使待测物部分溶于水中，与提取溶剂形成竞争关系，所以需要选择合适的除水剂除去肌肉组织中的水分。常用除水剂有氯化钠、无水硫酸钠、硫酸镁等，根据待测物的性质单独使用或复配使用。氯化钠通过分层来除水，无水硫酸钠、硫酸镁通过吸水除水；硫酸钠吸水快，水容量大，容易失水，在干燥体系易形成动态平衡，使干燥难以彻底，故只可作为初步吸附；无水硫酸镁吸附相对较慢，只能形成二结晶水，但吸附相对彻底，不适合用来吸附含水量较大的体系，且价格稍贵，不适合大批量使用。

2.2 净化过程

样品经提取溶剂、除水剂处理后，已经除去部分的脂肪、蛋白质以及水分等干扰物，提取溶剂除了能提取目标化合物和水分，同时也能提取样品组织中的其他杂质，想要有效地除去杂质，同时不吸附目标化合物，净化条件的选择也显得至关重要。QuEChERS 常用的净化方式为：常用净化剂、QuEChERS 净化柱。

QuEChERS 方法中常用净化剂：QuEChERS 的常用净化剂包括：C18、PSA、GCB、酸性氧化铝、硅藻土、-NH2净化剂、中性氧化铝；根据样本和待测物的性质选用单用或复配。PSA 含有2个氨基，能有效吸附糖类、脂肪、色素和其他极性有机酸。C18 有十八烷基官能团，能吸附脂肪等非极性干扰物，C18E 为封尾的 C18 净化剂填料，是疏水性较强的硅胶基体净化剂，对非极性化合物具有出色的保留特性，对大多数有机物都有保留；GCB 对平面结构分子有很强的亲和性，故能有效地去除色素和甾醇，同时也会吸附具有平面结构的兽药。硅藻土有很强的吸油率，能有效地除去脂肪。

3 QuEChERS 前处理技术应用实例

随着 QuEChERS 技术的不断改良，该技术在检测领域已普遍运用。我们以猪肉中磺胺药物残留检测为例，用检测机构常用的国标方法与QuEChERS 技术检测方法进行比较，在QuEChERS 技术检测方法中优化提取溶剂，确定除水剂及其用量，探究不同净化剂的净化效果，发现前处理过程操作简单、耗时短、有机溶剂用量少、成本低，为动物产品中兽药残留检测工作提供一定的参考。

QuEChERS 技术实验过程：

3.1 前期准备

3.1.1 试样制备

实验用的猪肉样品随机购于各大商超市，样品制备参照国标动物产品样品处理方法。经均匀捣碎后，样品分成两份，分别装入干净自封袋内，一份作为试样，一份作为留样，保存于-20℃。

3.1.2 主要仪器（生产厂家仅为参考）（见表1）

表1

3.1.3 实验试剂和耗材（生产厂家仅为参考） （见表2）

表2

3.1.4 标准物质（见表3）

表3

3.1.5 溶液配制方法

（1）0.1%甲酸乙腈溶液：0.1ml 甲酸溶于 99.9ml 乙腈。

（2）0.5%甲酸乙腈溶液：0.5ml 甲酸溶于 99.5ml 乙腈。

（3）乙腈饱和正己烷溶液：1：1 的乙腈与正己烷充分混合均匀，取上层待用。

（4）兽药标准中间溶液：分别准确量取一定体积的兽药标准储备液用色谱纯甲醇定容，混匀后制成浓度为10μg/ml 的标准中间液，-18℃条件下可存放 3 个月。

（5）兽药标准工作液：准确量取一定量的兽药标准中间溶液于容量瓶，用色谱纯甲醇定容至刻度，配制成的 1μg/ml 标准工作液，现用现配。

3.1.6 标准曲线制作

溶剂标准曲线：准确量取适量标准工作液，用 20%的甲醇水（v/v）稀释成 5、10、20、50、100、200ng/ml 的混合标准工作液，供LC-MS/MS 测定。

3.1.7 色谱条件

色谱柱：waters色 谱 柱（150mm×2.1mm，5μm）；柱温：40℃；流速：0.4ml/min；进样体积 5μL；流动相 A：0.1%甲酸水溶液，流动相 B：甲醇，梯度洗脱。离子化模式：电喷雾离子源（ESI），正离子模式，喷雾电压：3500 V，扫描模式：多反应监测（MRM）。

（1）结果计算 样品中各兽药计算公式如下，计算结果需扣除空白值。

式中：

Xi——样品中某一兽药的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；ci——样品制备液中兽药的浓度，单位为纳克每毫（ng/ml）；V——最终定容体积，单位为毫升（ml）；

2——稀释倍数；

m——样品质量，单位为克（g）。

（2）回收率计算 样品中某一兽药的回收率公式如下：

式中：

Ri——样品中某一兽药的回收率，单位为（%）；

Xi加标——某一兽药加标后试样测得的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；

Xi——样品中某一兽药的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；Mi——某一兽药实际加入样品中的含量，单位为微克每千克（μg/kg）。

3.2 实验方法

3.2.1 提取剂单因素实验

以乙腈0.1%甲酸乙腈、乙酸乙酯作为单因素条件，将磺胺类兽药在猪肉中加标浓度设为 100ng/ml，以回收率为衡量指标，考察上述提取液对磺胺常用4 种兽药的提取效果。

试样前处理

（1）提取

称取阴性猪肉（是指已检测未含有上述 4 种兽药的猪肉）5 g（精确至 0.01g）肌肉组织于 50 ml 离心管中，加入 2 ml 乙腈饱和正己烷；加入 10 ml 不同提取溶剂（① 乙腈；② 0.1%甲酸乙腈；③ 乙酸乙酯），立即涡旋1min（2500rpm），充分混合均质，超声 10 min，5000 r/min 离心 5 min。

（2）浓缩

准确移取5 ml 中间层提取液于氮吹管中，40℃氮吹至干，用 20%的甲醇水（v/v）定容至1 ml，涡旋，过 0.22μm 有机滤膜，供 LC-MS/MS 测定。

（3）测定

利用设置的色谱条件和质谱条件，将样品溶液进行测定，外标法定量，定量离子采用丰度最大的二级特征离子碎片。

3.2.2 除水剂单因素实验

（1）提取

称取阴性猪肉 5g（精确至0.01g）肌肉组织于50 ml 离心管中，加入2ml乙腈饱和正己烷；加入10ml 0.5%甲酸乙腈，加盖立即涡旋1min（2500rpm），充分混合均质，超声10min。

（2）脱水（考察以下 2 种情况）

加入不同的除水剂，加盖涡旋 1min（2500rpm），充分混合均质，超声5min，5000r/min 离心5min；

① 2g 氯化钠、2g 无水硫酸钠、2g 无水硫酸镁；② 硫酸钠（2g、4g）；

③加1g无水硫酸钠+1g无水硫酸镁、加2g无水硫酸钠+2g无水硫酸镁

（3）浓缩

准确移取5ml 中间层提取液于氮吹管中，40℃氮吹至干，用 20%的甲醇水（v/v）定容至1ml，涡旋，过0.22μm 有机滤膜，供 LC-MS/MS 测定。

（4）测定

利用设置的色谱条件和质谱条件，将样品溶液进行测定，外标法定量，定量离子采用丰度最大的二级特征离子碎片。

通过实验结果证明，一是QuEChERS 方法和国家标准的检测成本对比，QuEChERS 方法试剂成本65元，常规方法试剂成本212元，降低检测成本为69.3%。二是检测方法回收率同国标方法比对，QuEChERS 方法回收率能达到70%～95%，国标的方法结果在55%～90%。三是分析速度快，能在30min 内完成6个样品的处理。四是溶剂使用量少，污染小，价格低廉。五是操作简便，无需良好训练和较高技能便可很好地完成。六是样品制备过程中使用很少的玻璃器皿，装置简单。

QuEChERS 技术在动物产品检测中不同程度存在受基质效应干扰样品检测分析问题，影响样品的准确度、精密度、检出限和定量限，也会因检测过程中化学试剂含有毒有害物质，影响检测人员身体健康等问题。在检测操作中要充分评估各种风险，确保数据的准确性和可靠性。