氧化苦参碱对脂多糖诱导星形胶质细胞炎症因子释放的影响

胡文龙，谢雨瑶，杨新霞，牛丽伟，杨新生，杨菁

(1.锦州医科大学；2.锦州卫生学校外科教研室，辽宁 锦州 121000)

氧化苦参碱(OMT)为苦参和苦豆子的主要有效单体成分，在我国已有临床应用[1]。在临床上，有关氧化苦参碱的应用制剂主要为氧化苦参碱注射液、氧化苦参碱胶囊以及片剂，主要用于乙型肝炎及肿瘤的治疗。近年来的研究证据表明，氧化苦参碱具有抑制炎症、清除自由基、保护肝脏、免疫调节、神经保护等药理作用，可能在改善代谢和老龄相关认知功能退变等方面具有良好的临床应用前景[1]。OMT可以显著缓解急性脑梗死大鼠脑水肿，抑制炎症，从而发挥脑保护作用[2]。脑组织中星形胶质细胞(AS)的激活与炎症密切相关[3]。而在细胞水平上，OMT是否可以调节AS炎症因子释放，却未见报道。利用脂多糖(LPS)刺激AS，引起炎症反应[4]。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)与炎症反应、免疫应答等重要的病理过程密切相关。本研究利用分离纯化获得AS，并采用LPS刺激该细胞制备损伤模型，通过此模型观察OMT对炎症因子释放的影响；在此基础上，通过检测活性氧(ROS)含量及NF-κB激活状态探讨其作用机制，将OMT的作用机制引向深入。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂

24 h内新生SD大鼠，购自锦州医科大学实验动物中心。氧化苦参碱，纯度>99.0%，购自成都普瑞法科技开发有限公司。DMEM-F12培养液，购自美国Hyclone公司。脂多糖、D-Hank’s液、DAPI染液，购自北京索莱宝科技有限公司；2'，7' -二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)探针、0.25%胰酶-EDTA，购自碧云天生物技术有限公司；胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、P-NF-κB p65、β-actin一抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒购自上海通蔚实业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

按照文献方法进行试验[5]。取新生24 h内的SD大鼠，无菌取出双侧大脑皮质。皮质用D-Hank’s冲洗3次后，用眼科剪将皮质剪成小块。然后加0.25%胰蛋白酶溶液5 mL，10 min后等体积15%胎牛血清培养液。混合后过滤。细胞滤液加入无菌离心管中，1000×g离心5 min，弃上清液，试管中加入5 mL含15%胎牛血清的DMEM-F12培养液，吹打成悬液后转移到25 cm2培养瓶中，放培养箱中4 h后，再将含有细胞的培养液吸出，重新铺入新的培养瓶中，继续在培养箱中孵育。第2 d换1次液，以后每3 d换液1次。培养胞增殖至培养瓶底80%左右时传代。细胞培养到第三代时进行实验。

1.2.2 细胞纯度鉴定

第三代细胞接种于盖玻片，4 d后用PBS缓冲液冲洗，行常规免疫荧光实验方法，即盖玻片细胞用多聚甲醛固定。然后0.5% TritonX-100室温处理，血清封闭后加入小鼠抗GFAP单克隆一抗抗体，湿盒中4 ℃冰箱过夜，PBS缓冲液漂洗，加羊抗小鼠FITC单克隆二抗抗体，然后PBS缓冲液洗涤3次。DAPI复染，PBS缓冲液冲洗，最后倒置荧光显微镜下观察。选取3个视野进行计数。AS细胞GFAP 阳性，显绿色荧光，为含有的AS数量；DAPI染核，呈蓝色，为细胞总数，其比值为细胞纯度。

1.2.3 细胞分组和药物处理

当第三代细胞增殖到瓶底约80%时，利用无血清培养液继续培养24 h，对细胞进行同步化。同步化的细胞随机被分为对照组、LPS组、LPS+OMT组(100、300、900 μg/mL)。对照组仅加入培养液，继续培养 24 h；LPS 组则在培养液中加入终浓度为1 mg/L的 LPS后，继续培养 24 h[5]330-337；LPS+OMT组培养液中分别加入终浓度为 100、300、900 μg/mL 的OMT，1 h后再加入终浓度为 1 mg/L的LPS，继续培养24 h。

1.2.4 MTT法检测AS细胞存活率

按 1.2.3细胞分组和药物处理，按照参考文献方法进行实验[5]330-337。即继续培养 24 h后加入 20 μL MTT 溶液(5 g/L)，37 ℃培养4 h后 ，利用培养板离心机1000×g离心10 min后弃上清，然后每孔加入DMSO 150 μL后，震荡破坏细胞膜后，于490 nm波长测定吸光度(A)。以对照组的A值为100%，其它组与对照组进行对比。

1.2.5 DCFH-DA荧光探针法检测AS中ROS水平

按“1.2.3”细胞分组和药物处理，继续培养24 h后，避光加入1 mL按一定比例稀释的DCFH-DA探针(以1∶1000用不含血清的DMEM/F-12培养液稀释DCFH-DA)，于37 ℃、5%CO2培养箱培养25 min。所有孔避光弃上清，加入1 mL 0.25%胰酶细胞消化液，放入37 ℃、5%CO2培养箱消化，取出用显微镜观察，待细胞呈圆形，加入等体积完全培养液终止消化，并吹下所有贴壁细胞，分别收集细胞至15 mL离心管，800×g离心3 min。避光弃上清，每管加入3 mL PBS重悬细胞，800×g再次离心3 min。避光弃上清，每管加入500 μL PBS重悬，并转移到流式管内使用流式细胞仪进行检测，488 nm激发波长，525 nm发射波长。

1.2.6 Western Blot法检测P-NF-κB p65蛋白含量

培养细胞结束后用RIPA裂解液冰上裂解提取细胞总蛋白。调整蛋白含量至1 mg/mL。加热变形后利用10%的SDS-PAGE分离蛋白后再转移到PVDF膜上。膜用5% BSA封闭液，然后用TBST洗，然后加入p-NF-κB p65或β-actin一抗4 ℃过夜。次日采用TBST洗后，滴加HRP标记山羊抗兔二抗室温孵育。膜用TBST后用ECL显影液显影成像，用Image J软件对结果进行分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示。通过Shapiro-Wilk 和 Levene’s tests先检测所有数据均满足正态分布以及方差齐性。多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK方法，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AS细胞纯度鉴定

GFAP主要分布于中枢神经系统的AS中，参与细胞骨架的构成，是AS鉴定的公认标志物。实验结果显示，98%以上的细胞显示绿色荧光，即表明培养的细胞纯度为98%以上。能满足实验的需要，实验细胞均采用该条件下分离纯化后进行实验，见图1。

图1 培养细胞纯度鉴定(200×)

2.2 OMT对LPS诱导星型胶质细胞存活率的影响

MTT检测OMT对LPS诱导的大鼠星型胶质细胞存活率的影响。结果表1所示，LPS组细胞存活率降低至对照的49.5%，差异有统计学意义(P<0.001)，说明LPS造成了细胞损伤。与LPS组比较，LPS+OMT(100、300、900 μg/mL)组细胞存活率升高，分别为63.7%、77%、91.7%，差异均有统计学意义(P<0.001)，说明OMT对LPS造成的细胞损伤具有保护作用。从效果看，随着浓度的升高，保护效果越强。

表1 OMT对LPS诱导星型胶质细胞存活率的影响

2.3 OMT对LPS诱导星型胶质细胞培养液中IL-1β和TNF-α的影响

为观察OMT对AS细胞炎症因子释放的影响，采用ELSA方法对培养液中IL-1β和TNF-α含量进行了检测。实验结果发现，LPS组AS培养液中IL-1β和TNF-α水平比对照组明显升高(P<0.001)。当培养液中加入100、300、900 μg/mL OMT后可以明显抑制LPS引起的IL-1β和TNF-α释放(P<0.001)，并且浓度越高抑制效果越明显，见表2。

2.4 OMT对LPS诱导星型胶质细胞ROS水平的影响

活性氧(ROS)是指氧的某些代谢产物和一些反应的含氧产物，主要包括超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等[6]。ROS是导致细胞氧化应激的主要因素之一，本实验通过DCFH-DA荧光探针法检测细胞中ROS水平[6]975-977，见图4。可见LPS组AS中，ROS水平由对照组的19.80%，升高至55.60%(P<0.001)。与LPS组比较，LPS+OMT(100、300、900 μg/mL)组细胞中ROS含量分别降低至44.90%、39.90%、32.20%，提示OMT可有效抑制LPS诱导的AS氧化损伤，见图2。

表2 OMT对LPS诱导星型胶质细胞培养液中IL-1β和TNF-α的影响

A:对照组；B：LPS组；C：LPS+OMT 100 μg/mL；D:LPS+OMT 300 μg/mL；E：LPS+OMT 900 μg/mL；F:各组ROS含量，与LPS组相比，** P<0.001图2 OMT对LPS诱导星型胶质细胞ROS水平的影响

2.5 OMT对LPS诱导星型胶质细胞中P-NF-κB p65蛋白的影响

OMT对LPS引起的胰岛内皮细胞P-NF-κB p65升高具有抑制作用[7]，因此推测OMT也可能通过同样的机制在AS细胞中挥作用。结果显示，LPS组AS中P-NF-κB p65蛋白表达量是对照组的2.2倍。LPS+OMT(100、300、900 μg/mL)P-NF-κB p65蛋白表达水平明显降低(P<0.001)，其中又以900 μg/mL OMT组最明显，见图3。

与LPS组相比，**P<0.001图3 Western Blot法检测OMT对LPS诱导星型胶质细胞中P-NF-κB p65蛋白的影响

3 讨 论

缺血性脑卒中是造成患者脑功能障碍的常见疾病。在脑缺血等病理情况下，AS出现活化，缺血区周围有大量AS的聚集，对于恢复脑功能具有积极作用。但过度的AS聚集活化引起的炎症对神经元却又有不利影响[8-9]。在分离的大鼠皮层细胞中，有神经细胞、星型胶质细胞、小胶质细胞、成纤维细胞等。为确保实验结果的可靠性，本实验选用差速贴壁技术、传代等技术，获得了纯度98%以上的AS细胞进行实验。LPS由类脂 A、核心多糖和O-多糖侧链组成，常在体外研究中刺激诱导AS活化，引起炎症，是常用的刺激物[10]。作者选通用的1 mg/L LPS对AS进行刺激，结果发现AS细胞IL-1β和TNF-α释放水平升高接近对照组的3倍，说明模型构建成功。再此基础上，对OMT的抗炎效果进行了测定，结果表明100、300、900 μg/mL OMT对与LPS刺激释放的IL-1β和TNF-α均具有抑制作用，且具有剂量效应关系。

氧化应激损伤是由ROS生成能力与消除能力失衡导致。AS细胞激活后，可以通过提高GSH生成、增强过氧化物酶等发挥抗氧化作用，但过度升高可造成细胞损伤[11]。实验结果表明LPS可以引起AS细胞内ROS含量明显升高，而OMT对ROS的升高具有抑制作用，说明OMT的抗炎作用可能与抑制氧化应激有关。

细胞内的ROS升高会触发一系列信号通路，包括激活NF-κB[12]。NF-κB有p50和p65两个亚基，它是转录因子，可以促进IL-1β和TNF-α的释放引发炎症反应，发挥保护作用，但过度激活也可以IL-1β和TNF-α的过度释放，反而造成细胞损伤[13]。中枢神经系统的炎性反应主要通过NF-κB p65亚基发挥调节作用。未刺激时，NF-κB p65与NF-κB抑制蛋白结合在胞浆中。当受刺激后，NF-κB p65被磷酸化激活，引起变构，脱离抑制蛋白后进入细胞核内[14]，促炎症因子表达及释放。NF-κB p65的磷酸化是该过程的关键[15]。实验结果显示，LPS导致AS的P-NF-κB p65含量明显升高，而OMT对LPS诱导的NF-κB p65磷酸化具有抑制作用，因此有理由推测OMT可能是通过抑制κB p65磷酸化，进而减少炎症因子IL-1β和TNF-α的释放。

综上所述，OMT可抑制LPS引起的AS损伤及炎症因子的释放，其机制可能与其清除ROS、抑制NF-κB p65磷酸化来发挥作用。但同时也意识到，脑内小胶质细胞是中枢神经中参与炎症反应的主要细胞，而OMT对小胶质细胞及其与AS细胞的相互影响仍需进一步研究。