蒙药三黄膏质量标准研究*

魏金辉，谭谊萌，吴丽君，杨 丹，薄彧坤，安 明

(内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古包头 014040)

蒙药三黄膏是由黄连、苦参、黄柏、黄芩4味药制成的棕褐色膏状制剂，在蒙药中历史悠久。黄连[1-2]、黄柏[3]均具有清热燥湿、泻火解毒的作用；黄芩的功效为清热燥湿、抗菌止血[4]；苦参则具有清热解毒、抗炎镇痛的药理活性[5]。其中黄连、黄柏所含的盐酸小檗碱对炎症具有抑制作用，可以缓解疼痛，与药效密切相关。全方清热解毒、消肿止痛，具有抗菌和增强免疫作用[6-7]，在临床上对皮炎、湿疹、疖痈治疗效果显著。该制剂制备简单、便于临床调配和使用。但由于提取工艺的不同，其质量差别较大，疗效也受到了影响[8-9]。为提高三黄膏的内在质量，本研究以与药效密切相关的盐酸小檗碱为指标成分，拟建立三黄膏中黄连、黄柏的薄层色谱(TLC)鉴别标准，并使用高效液相色谱法(HPLC)测定盐酸小檗碱的含量，制定含量测定限度，从而加强其质量控制。

1 材料与方法

1.1仪器 GenPure UV-TOC/UF超纯水机、Thermo Ultimate3000高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)；BSA224S-CW万分之一电子天平、SQP型十万分之一电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；AS10200(40/60HZ)超声波清洗仪(北京华瑞博远科技发展有限公司)；TDZ5-WS多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2试剂药品 盐酸小檗碱对照品(AF20060151)、盐酸黄柏碱对照品(AF21020861)、黄连对照药材(AF20060108)、黄柏对照药材(AF21020512)购于成都埃尔法生物科技有限公司；黄连药材(181226)、黄柏药材(190501)、三黄膏(2012111、2012112、2012114)由包头市蒙医中医院提供；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3方法

1.3.1TLC鉴别 黄连TLC鉴别：取黄连药材0.25 g、三黄膏1.0 g、黄连对照药材0.25 g、阴性1(不含黄连的处方其余药材)0.75 g、阴性2(不含黄柏的处方其余药材)0.75 g、阴性3(不含黄连、黄柏的处方其余药材)0.50 g，加入甲醇25 mL后，超声处理30 min，静置，离心，取上清液即得。取盐酸小檗碱对照品适量，配制成0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。照TLC(2020版《中国药典》四部通则0502)试验，吸取上述溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，配制环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶1∶1)混合溶液作为展开剂，置于提前用氨蒸气饱和20 min的展开缸内，展开，取出后晾干，放置于紫外光灯365 nm下检视。

黄柏TLC鉴别：取黄柏药材0.25 g、三黄膏0.8 g、黄柏对照药材0.1 g、阴性(不含黄柏的处方其余药材)0.6 g。加入1 %醋酸甲醇溶液40 mL，在60 ℃温度下超声20 min，放置至常温，滤过，浓缩滤液至2 mL即得。取盐酸黄柏碱对照品适量，加甲醇制成每0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。照TLC(2020版《中国药典》四部通则0502)试验，分别吸取5 μL上述溶液,点于同一个硅胶 G 薄层板上，先将层析缸用氨蒸气预先饱和20min，再将三氯甲烷-甲醇-水(30∶15∶4)配置好，摇匀倒入分液漏斗中，静置进行分液，取下层溶液作为展开剂，倒入饱和好的展开缸内，展开，取出并晾干。

1.3.2含量测定

1.3.2.1色谱条件 色谱柱SinoChrom ODS-BP C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-0.2 %磷酸水溶液(29∶10∶61)；流速1.0 mL/min；检测波长345 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

1.3.2.2对照品溶液的制备 精密称定盐酸小檗碱对照品9.12 mg至10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，再精密吸取1 mL置另一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，制成91.2 μg/mL的对照品溶液。

1.3.2.3供试品溶液的制备 取本品约0.13 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超声20 min，放冷，补重，5 000 r/min离心10min，取续滤液即得。

2 结果

2.1TLC鉴别

2.1.1黄连TLC鉴别 在与对照品及对照药材色谱相对应的位置上，供试品显相同颜色的斑点，阴性对照溶液1、2中均有盐酸小檗碱的斑点，阴性对照溶液3无干扰。见图1。

2.1.2黄柏TLC鉴别 在与对照品、对照药材薄层色谱相对应的位置上，显相同颜色、大小的斑点，阴性无干扰。见图2。

图2 三黄膏中黄柏的TLC图谱

2.2含量测定

2.2.1专属性 精密吸取“1.3.2”项下配制的溶液各10 μL进样，结果表明，阴性对照色谱图中，在与盐酸小檗碱对照品以及供试品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现，专属性好。见图3～图5。

图3 阴性对照溶液色谱图

图4 盐酸小檗碱对照品色谱图

图5 供试品溶液色谱图

2.2.2取样量考察 照“1.3.2.3”项下供试品溶液制备方法，以甲醇作为提取溶剂，超声20 min即得，进行盐酸小檗碱含量测定。三份样品中0.1357 g测定的盐酸小檗碱含量高于0.2036 g，故取样量选择0.1357 g。见表1。

表1 盐酸小檗碱含量测定取样量考察

2.2.3提取时间考察 以甲醇为提取溶剂，考察不同超声时间对提取效率的影响。三份样品中超声时间为50 min的溶液中盐酸小檗碱的含量最高，故选择超声50 min为提取时间。见表2。

表2 盐酸小檗碱含量测定提取时间考察

2.2.4提取温度考察 以甲醇为提取溶剂，考察不同提取温度对提取效率的影响。随着提取时间的增加，盐酸小檗碱的含量有所降低，故选择40 ℃为提取温度。见表3。

表3 盐酸小檗碱含量测定提取温度考察

2.2.5线性关系考察 精密量取对照品溶液0.046、0.095、0.140、0.185、0.230和0.276 mL分别置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，采用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液。取上述溶液10 μL进样，以峰面积对浓度进行回归分析，结果在45.72 μg/mL～274.34 μg/mL浓度范围内，线性关系良好，y=0.1643x+6.7144，r2=0.9992,n=6。见表4。

表4 盐酸小檗碱标准曲线数值表

2.2.6精密度试验 取“1.3.2.2”项下的对照品溶液，按照“1.3.2.1”项下的色谱条件连续重复进样6次，进样量为10 μL，其峰面积的平均值为60.6893，RSD为0.87 %，说明精密度良好。见表5。

表5 盐酸小檗碱含量测定的精密度结果

2.2.7稳定性试验 取同一份供试品溶液，精密吸取10 μL，按色谱条件，分别在0、2、4、6、12、24 h下进样10 μL，根据色谱图中盐酸小檗碱的色谱峰面积的数值对RSD值进行计算，RSD为0.49 %(按外标峰面积计算)，表明此方法下盐酸小檗碱的稳定性良好，该方法准确可行。见表6。

表6 不同时间测定样品中盐酸小檗碱的峰面积

2.2.8重复性试验 取同一批号(2012111)供试品6份，每份约0.13 g，精密称定，照“1.3.2.3”项下供试品溶液制备方法，照高效液相色谱法(《中国药典》2020版四部通则(0512))，在345 nm波长处测定峰面积，按外标峰面积计算。见表7。

表7 盐酸小檗碱含量测定重复性试验结果

2.2.9加样回收率试验 取批号2012111样品9份，每份约0.06 g，精密称定，照“1.3.2.3”项下供试品溶液制备方法，照高效液相色谱法(《中国药典》2020版四部通则(0512))，在345 nm波长处测定峰面积，按外标峰面积计算。见表8。

表8 盐酸小檗碱含量测定加样回收试验结果

2.2.10耐用性试验 换不同厂家、不同型号色谱柱，取供试品约 0.13 g，精密称定，照“1.3.2”项下含量测定方法进样，按外标峰面积计算，测定盐酸小檗碱的含量，结果为：RSD<2.0 %。见表9。

表9 不同色谱柱的耐用性试验

2.2.11样品含量测定 取三个批号的样品(生产批号为2012111、2012112、2012114)，每批2份，另取模拟样品2份，照“1.3.2”项下含量测定方法进样，分析测定，含量均在3.4 mg/g以上；采用同法，对模拟样品用黄连药材进行含量测定。见表10。

表10 样品中盐酸小檗碱含量测定结果

3 讨论

3.1展开剂的选择 依照《中国药典》2020版一部“黄连”项下TLC鉴别方法，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)为展开剂，分离程度小，展开斑点不清晰。采用加大极性的方法将展开剂中水的比例扩大1和1.5倍。结果表明，当水的比例扩大1倍时，展开剂展开效果好，斑点相互分离且清晰无干扰。故以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶1∶1)作为展开剂。

3.2流动相的选择 本实验考察了不同比例甲醇-乙腈-0.2 %磷酸水溶液的流动相体系，当甲醇-乙腈-0.2 %磷酸水溶液比例为25∶10∶65时峰形较差、基线波动较大。加大流动相中甲醇的比例，当甲醇-乙腈-0.2 %磷酸水溶液比例为29∶10∶61时色谱峰分离度好，峰形良好。故最终确定色谱条件为甲醇-乙腈-0.2 %磷酸水溶液(29∶10∶61)。

3.3检测波长的选择 通过全波长扫描，供试品在229、265和346 nm波长处有吸收，结果显示346 nm波长处基线较为平稳。查阅《中国药典》2020版一部“黄连”项下盐酸小檗碱含量测定的波长，最终以345 nm作为检测波长。

本研究以盐酸小檗碱为指标成分建立的蒙药三黄膏中黄连[10-11]、黄柏[12-13]的TLC定性鉴别方法，在与对照药材或对照品色谱的相应位置上，样品显相同颜色的斑点，阴性无干扰；同时测定了盐酸小檗碱的含量[6,14-15]，并考察了提取时间、提取温度对提取效率的影响[16]，以节约成本、全面反映制剂内在质量为目的[17]，选择了50 min、40 ℃作为样品的提取条件；盐酸小檗碱在45 ～274 μg/mL范围内呈现良好的线性关系；平均回收率为94.16 %。建立的盐酸小檗碱含量测定方法专属性强，分离度高，结果准确可靠。

综上所述，本研究提升了蒙药三黄膏的质量标准，为产品质量控制提供了依据。