EDU缓解稻麦臭氧胁迫的作用与机制研究进展

刘园园，苏熠，王琪

（南京信息工程大学应用气象学院，江苏 南京 210044）

臭氧（O3）是温暖晴朗天气下氮氧化物和挥发性有机化合物经光化学氧化反应产生的一种氧化性气体，其地表背景浓度为20～40 μg/L[1]。O3浓度超过正常的本底浓度后，就会成为空气污染物[2]，不仅对植物产生伤害，还影响人体健康。

在过去的30年里，人们对O3的研究越来越多。O3是全球范围内能严重伤害植物的空气污染物之一，工业革命以来的人为活动致使近年来O3浓度一直呈迅速升高趋势[3]。据估计，在未来几十年里北半球的地面O3浓度还会继续以每年0.5%～2.0%的速度增长，到2060年全球平均地表浓度将达到40～60 μg/m3[1]。近几十年来，我国许多城市和地区经历了高O3事件，且地表O3浓度呈上升趋势。目前我国存在着难以想象的O3污染，2005～2010年O3年平均浓度峰值高达60 μg/L[4]。空气监测发现，亚洲一些地区的重要农作物生长季节，O3月平均浓度达到50 μg/L十分常见[5]。印度学者进行模型研究后认为，未来几年O3浓度将会进一步升高[6，7]。

高浓度的O3会对植物造成各个方面的不利影响，其直接影响植物的生理生化过程，从而可能导致植物对其他生物或非生物胁迫应激反应降低[8]。如，O3胁迫可能会导致植物叶绿素含量下降，光合作用和气孔导度降低[9]；降低植物的抗氧化剂水平，加速叶片衰老[10]，最终导致植物总生物量和营养产量降低[11～15]。最近一项关于全球性O3污染导致作物减产的风险评估数据显示，2010～2012年我国每年因为O3污染造成的水稻、小麦减产幅度分别为8.1%和9.8%[16]。长三角地区是我国经济发展活跃区域之一，也是我国农作物主产区和O3主要污染区，2014～2017年O3污染导致该区域水稻年均减产2 445百万t，年经济损失约为10亿美元[17]。由于水稻种植季节与环境的O3浓度峰值重叠，今后由O3污染造成的产量损失将进一步加大[18]。小麦是仅次于玉米的第二大粮食作物，2016年世界小麦产量为7.49亿t（粮农组织2016年）。我国小麦主产省位于华北平原以及华中和华东地区，这些区域也是O3污染严重的地区[19]。一项meta分析表明，与生长在木炭过滤空气中的植物相比，O3浓度升高（50～75 μg/L）会造成小麦减产24%[12]。据估计，因O3浓度升高，2030年全球小麦产量与2000年相比将下降4%～17%[20]。可以看出，当前我国高浓度O3对稻麦作物的负面影响已经到了不容忽视的地步。

意识到O3污染的严重性后，人们开始寻找解决办法。1978年Carnahan等[21]报道了一种名为Ethylenediurea（EDU）的物质，似乎在保护植物免受O3伤害方面非常有效。截至目前，EDU仍被人们广泛应用于缓解O3胁迫的不良影响。众多研究也表明了EDU能够有效抑制O3胁迫，对许多受O3胁迫的植物如水稻[22]、小麦[23]、玉米[24]、豆类[25]和杨树[26]等具有明显的保护作用。对EDU缓解稻麦臭氧胁迫的作用与机制研究进展进行综述，以期提高人们对EDU缓解O3胁迫作用机理的认识，有利于在O3浓度较高的情况下合理应用EDU来保护作物。

1 EDU的简介

1.1 EDU的由来

EDU由杜邦公司于1970年开发出来，并在1975年首次被人们发现具有抗O3胁迫的作用。EDU是一种非商业性化合物，但截至目前尚未见到其合成的详细报道。EDU基本的两大组成是尿素（U）和苯基脲（PU），在EDU的相对分子质量中，U、PU分别占23.46%和53.18%。EDU是一种含氮化合物，其中10.5%的氮素来自尿素，10.94%的氮素来自苯基脲成分[27]。从EDU的分子结构（图1）可以看出，由于Remarkably化合物不含烯烃双键，因此不太可能直接清除O3[2]。

图1 EDU的分子结构Fig.1 Molecular formula of EDU

1.2 EDU在植物体内的运输和吸收

众所周知，当O3通过气孔进入叶片，到达细胞膜或细胞壁，即质外体时，就开始对植物组织产生影响[28，29]。O3是通过破坏植物的膜结构和通过膜中脂质的过氧化作用改变膜的通透性，从而影响植物细胞膜的[30]。前人研究结果表明，EDU对受O3胁迫植物的保护作用发生在植物的质外体中，而不是发生在原生质体中[31～34]。

EDU在注射后不久就开始遵循顶瓣方向在植物器官里移动，并且速度很快[35]；使用2 h后，便会出现在植物的所有组织，并且EDU浓度随着使用后时间的推移而增加，直至应用的剂量被吸收[32]。植物根和茎中的EDU浓度随使用后时间的延长而降低，但是叶片中的EDU浓度不存在该现象。

1.3 EDU的应用方式

1.3.1 茎注射 该方法主要适用于树木，是对树木木质组织注入化学物质的有效使用方法。但不论是作物还是树木，与其他2种方式相比，该方法所需EDU剂量均较小[36]，且效果好于土壤喷施法。应用该方法需要在树木上打开多个孔才能促进EDU充分吸收，所以会对树木造成伤口，加大疾病感染的风险，且使用过程较土壤喷施和叶面喷施更复杂、耗时。

1.3.2 土壤喷施 该方法较其他2种方法使用简单，且节省时间。但在使用过程中，需要考虑到影响EDU吸收和有效性的土壤因素，如土壤微生物数量、土壤有机质含量、土壤肥力、土壤结构等[2，37]。

1.3.3 叶面喷施 该方法是在稻麦作物上最常用的方法，使用剂量根据作物叶面积而定。该方式需要在植物气孔完全打开时才能应用；在多风、干燥地区，植物气孔大多关闭，EDU使用后可能无效，这种情况下需要在每次施用前一天对植物进行灌溉[36]。

1.4 EDU的适用浓度及有效时间

印度的一项研究表明，400 mg/L的EDU去评估环境O3的影响最有效，且能够为生长好、产量高的小麦品种提供最大程度的保护。当EDU施用浓度达到400 mg/L以上时，对小麦正常生长无明显影响。此外，仅在植物生命的特定阶段或仅在旗叶上施用EDU不足以评估O3对植株的影响，因此在植株的整个生长期都需要施用EDU。需要注意的是，EDU叶面喷施1 h后若受到雨水冲洗，其浓度将在第3天开始下降[38]。一般来说，EDU在植物体内可以留存8～15 d，但在植物中的有效性和持久性因植物类型而异，因此需重复施用。

关于EDU的施用量，有人提出通过植物总叶面积来计算，因此，每次施用的EDU剂量较整个生长季节施用的EDU累计总剂量更有意义。已有证据表明，应用茎注射方式，按叶面积施用13～26 mg/m2的EDU，可有效防止O3毒性[38，39]。根据Agathokleou提供的数据进行重新计算，结果表明，按叶面积喷施14.6～29.1 mg/m2的EDU，相当于叶面喷施EDU的浓度为200 mg/L，可提供足够的保护作用[40]。

2 EDU的作用

2.1 作为筛选作物O3耐性的工具

O3浓度不断升高对粮食安全造成了一定威胁，我们要培育出适应高浓度O3环境的优良作物品种，以确保粮食安全生产。这就要求我们在育种过程中对作物的高浓度O3适应性进行充分的实地评估，但是O3熏蒸设施的技术挑战和建设成本都很大。近年来有研究表明，可以通过EDU来评估大田条件下O3对作物的负面影响，如利用EDU筛选稻麦作物及部分树种对O3的敏感程度[41～44，2，37]，因为O3胁迫下，对O3敏感的基因型植物对EDU的反应较耐O3基因型植物强烈得多。Ashrafuzzaman等[45]为了研究EDU作为筛选作物是耐O3型还是敏感型的有效工具，选取3个不同基因型的水稻（耐O3型L81，敏感型NB和BR28）采用4种处理方式（空白对照，施用EDU的对照，O3处理，施用EDU的O3处理）研究了不同基因型水稻对EDU的反应，结果表明，O3胁迫处理下，施用EDU对水稻MDA含量、SPAD值、气孔导度和光谱反射指数具有显著影响，其中，对敏感基因型BR28和NB的单位面积穗数、穗粒数等重要产量性状影响显著，而对耐性基因型L81仅在株高、SPAD值和气孔导度等少数性状上影响较大。因此，EDU可以作为改良稻麦作物杂种优势的有效工具，用来筛选稻麦作物及其不同品种在自然田间条件下对O3的敏感性。尤其在O3监测技术尚不成熟的发展中国家，使用EDU评估O3对植物的影响很有必要。在未来O3浓度升高的环境下，通过改良作物性状培育耐O3或抗O3稻麦新品种可有效提升稻麦产量[46]，预计到2030年由高浓度O3引起的全球作物损害较2000年可减轻12%[47]，最终有望基本消除高浓度O3对作物造成的破坏性影响，确保全球粮食安全。

2.2 对稻麦作物的影响

2.2.1 对稻麦作物生长和形态参数的影响 以往研究早已证实，高浓度O3胁迫下施用EDU可以保护植物进行正常生长。研究表明，EDU能够改善高O3胁迫植物的各种形态参数[48，49]，300 mg/L处理下小麦株高显著增加[50]，500 mg/L处理下小麦叶片数量明显增多[51]。

2.2.2 对稻麦作物生物量和产量的影响 高浓度O3胁迫会加速稻麦作物叶片衰老，表现为脂质氧化增强，色素含量和光合速率快速下降[52]，最终导致千粒重和产量降低[53]。施用EDU可以减少O3对稻麦作物的可见伤害和生长衰退[2]，尽管这种保护作用通常并不完美。EDU处理后，相对生长速率和净同化率等生长指标提高，表明生物积累量增加，植物已经克服了O3的负面影响[54]；比叶重增大，表明光合产物在叶片分配得较多，导致有效叶面积比高于非EDU处理。与未EDU处理的对照组相比，450 mg/L的EDU处理可明显提高水稻叶、穗、茎、芽、根以及整个植物的干物质重，指标值增幅分别为15.3%、16.2%、25.3%、18.2%、23.9%和18.7%[55]。

EDU对受O3胁迫稻麦作物的保护作用最终体现在产量和产量性状上，EDU处理的稻麦作物产量和产量性状较未处理对照显著增加。在作物生长过程中重复施用EDU，可为作物提供一系列的保护，最终使产量增加（图2）。EDU能使营养生长期的叶片保持较高的生物量，并将更多的光合产物转移到生殖部位，从而提高产量[56]。与水分处理相比，EDU处理的所有品种小麦均可显著提高千粒重和收获指数，指标值增幅分别为16.7%和17.7%[57]。环境O3浓度为34.2～54.2 μg/L时，400 mg/L的EDU处理可显著提高小麦产量，且对O3越敏感的品种对EDU处理的反应越积极，5个小麦品种（HUW468、HUW510、HUW234、Sonalika和PBW343）中最敏感品种HUW468施用EDU后增产幅度最大[48]。Agrawal等[51]也发现了类似现象，在产量上HUW468对O3的敏感性高于其他小麦品种（HUW234和HD2329）。Shang等[55]研究表明，水稻在2个不同浓度的O3（NF和NF60）胁迫下，EDU处理的水稻平均产量和千粒重较非EDU处理分别提高16.4%和6.7%；且O3×EDU互作效应显著，NF60较NF显著降低了非EDU处理植株的穗粒数。因此，EDU处理不仅能防止作物总产量损失，还能有效避免作物产量构成的其他因素受到影响。

图2 作物生长过程中施用EDU对作物的积极影响Fig.2 The positive impact of EDU on crops during growth

3 EDU的作用机制

3.1 生理学机制

EDU在缓解O3对植物的伤害方面具有积极作用。研究表明，EDU可能通过直接影响生理参数或通过抗氧化剂介导的防御反应来清除O3对植物的有害活动[2]。O3通过植物膜中脂质的过氧化作用影响膜的通透性，而EDU可以通过清除O3产生的活性氧和提高相关自由基的酶活性来保护植物组织免受脂质过氧化。O3会在细胞间隙产生一系列潜在的破坏性活性氧（ROS），从而引发抗氧化反应[58]。同时在叶子内部潮湿的环境中这些氧化过程会产生H2O2，这是很重要的O3衍生氧化剂之一，它的产生可能会导致其他ROS如超氧化物和羟基自由基的形成[59]。ROS能够氧化细胞成分如脂质、蛋白质、巯基和核酸，并引发自由基连锁反应[60]。研究表明，EDU对受O3胁迫植物的积极影响是因为EDU引起了植物质外体抗氧化剂水平的变化，从而提高ROS清除酶的效率[61]。植物体内的几种抗氧化剂（如抗坏血酸、谷胱甘肽）和抗氧化酶〔如抗坏血酸过氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）〕可保护植物免受O3的氧化伤害。在芥菜上的研究结果显示，EDU处理后可诱导抗坏血酸含量增加，谷胱甘肽循环酶、SOD和CAT活性提高，这对ROS解毒有很大帮助[62]。

O3胁迫对植物类囊体膜中的电子传递过程会产生负面影响[63]，而EDU处理可保护叶绿素免受损失[64]。有研究显示，EDU处理有助于缓解O3诱导的PSⅡ反应中心失活等问题[65]，且对光反应的积极影响能够延续到暗反应中，使植物光合速率提高，主要表现为植物固碳能力的增强。但大多数研究表明，EDU对植物光合作用的影响并不显著[48，66]。值得思考的是，既然EDU对植物的光合作用无明显影响，那么，为什么经过EDU处理后植物会生长得更好？探究EDU对O3环境中几种植物气孔导度的影响，结果显示，EDU并未对气孔导度产生直接影响[67，68]。一项关于EDU对植物影响的分析也表明，EDU对植物气孔的直接影响甚微[44]。可以看出O3对植物气孔的作用机制复杂，今后应在这方面开展更多的研究和探讨。

3.2 遗传学机制

2018年Ashrafuzzaman等[18]将O3敏感和耐受的水稻品种暴露于O3和对照环境中，然后对水稻进行RNA测序，并对转录图谱进行分析，结果显示，对O3敏感的品种有上千个基因对O3做出了反应，却没有一个基因对EDU做出反应。该研究结果为EDU是一种表面保护剂提供了有力证据，说明EDU可以在不直接干扰植物胁迫反应系统的情况下减轻O3胁迫。

Gupta等[24]通过鉴定小麦叶片质外体和叶绿体中的EDU响应蛋白，启动了MAE的蛋白质组学研究。这是首次对质外体和叶绿体分离株响应EDU蛋白质组学的研究。结果表明，EDU能够影响植物的光合作用蛋白，同时减轻ROS造成的氧化压力。使用1D/2D PAGE对2种EDU浓度（200、300 mg/L）的叶绿体分离蛋白在高浓度O3条件下进行蛋白质组图谱分析，并从2个小麦品种（Kundan、PBW 343）的鲜叶中分离出质外体和叶绿体，结果表明，质外体蛋白（如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、类胚芽蛋白和抗坏血酸过氧化物酶）通过维持O3胁迫下的最佳ROS池来达到清除O3损害的作用。在叶绿体中，参与光合作用、能量代谢和PSAD的蛋白如Rubisco LSU、OEE、细胞色素b-6-f复合物、捕光a/b结合蛋白、FNR等增加了蛋白丰度，以应对O3胁迫带来的不利影响。这一研究极大地扩展了我们对EDU作用模式的认知。分析叶绿体分离株的蛋白质丰度模式，可以从分子水平上更好地解释在普遍的O3胁迫下EDU是如何影响光合作用机制的。

4 总结与讨论

通过文献分析，我们很清楚地了解到EDU对遭受O3胁迫的植物具有一定的保护作用，且稻麦敏感品种对这种保护反应更加显著。虽然这种保护并不完美，但在一定程度上能够减少O3胁迫造成的损失。EDU可以作为检测稻麦作物品种对O3敏感性的有效工具，用于培育耐O3品种，降低高O3造成的损失，在一定程度上确保粮食安全。

EDU对稻麦作物的保护作用是系统性的，对作物的生理生化过程以及生物量和产量均有一定的积极效应，但是具体的代谢途径我们还不完全明白。目前专家们对EDU的保护作用研究已经开始往“组学”方面深入，这将使我们在未来能够更加清楚地了解EDU的保护机制。现阶段应用“组学”工具解释EDU的作用机制研究较少，基因表达和蛋白质谱的研究可以帮助我们更好地了解EDU使植物免受O3伤害、提供部分保护的实际机制。