荧光定量PCR在药用植物基因表达及鉴别中的应用

李柯帆 王 枫 丁 雯 李晓兰 杜晨晖 闫 艳 裴香萍

(1 山西中医药大学中药与食品工程学院，太原，030619； 2 山西大学中医药现代研究中心，太原，030006)

化学定量分析方法由重量分析、容量分析与仪器分析3部分组成。其中仪器分析方法已广泛应用于中药化学成分分离与鉴别、药代动力学研究中的活性成分检测、中药材与中成药质量控制等。核酸作为生命的最基本物质之一，对于药用植物的生长以及活性成分的合成过程至关重要，关于中药化学成分的分析方法已建立较为成熟的体系，而目前常用分子定量技术对核酸进行定性定量的研究。

分子定量技术包括实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)和数字PCR(Digital PCR，dPCR)。其中qRT-PCR技术为实现核酸定性定量研究奠定基础，qRT-PCR技术是通过在PCR体系中加入荧光结合集团或荧光探针，利用荧光信号的累积对整个PCR进程进行实时监测的技术。通过实时监测荧光量的变化，获得待测物质达到荧光检测阈值的循环数(Cycle Threshold，Ct值)[1]。PCR过程中，可以通过荧光信号的强度变化实时监测扩增产物量的变化[2]。实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性好、定量准确、快速简便及高通量等特点，因此在微生物分析、食品科学研究、临床诊断、肿瘤早期研究等领域的应用十分广泛。qRT-PCR在微生物生态学领域中常用于对微生物群落的生理代谢、空间分布及动态变化等过程的监测[3]。在医学领域常用于染色体病、基因病的诊断，对肿瘤早期诊断、分型与分期的判断，以及对病原体DNA的定性及定量检测方面的研究[4]。在食品科学领域常用于对食品中可能含有的有害细菌进行定量检测分析，针对转基因食品安全问题建立转基因食品检测方法[5-6]。近年来，随着分子生物学技术以及合成生物学领域的相关发展，其在药用植物基因表达与药用植物品种鉴别中的应用也越来越广泛。

1 药用植物基因表达分析

实时荧光定量PCR是基因分析表达的一种有效方法，能够检测目标基因在mRNA水平上的表达差异，以内参基因作为标准的相对定量是目前最常用的DNA定量方法，内参基因能够校正目的基因的相对表达量，确保PCR定量结果的准确性，对于目的基因表达的差异分析是理清药用植物中活性物质合成途径的先决条件，因此筛选出稳定的内参基因能够为目的基因表达差异的进一步分析奠定基础。近几年在中药领域，qRT-PCR技术在药用植物基因表达分析中得到广泛应用，目前在何首乌、北柴胡、连翘、茅苍术、沙氏鹿茸草、远志和越南参变种(野三七)等药用植物中研究报道较多[7-19]。

1.1 药用植物内参基因的筛选 将在药用植物各组织和细胞中表达均相对恒定的内参基因作为内部参照，能够校正基因研究过程中存在的系统误差，确保实验结果定量准确。王丽平等[20]利用qRT-PCR技术分析候选基因的组织特异性表达，实验数据经过geNorm和NormFinder软件处理，从千里光15个候选基因中筛选出表达稳定的内参基因ACT1，为后续千里光中的重要基因表达及其作用机制的研究奠定基础。荆礼等[21]利用geNorm等相关软件及qRT-PCR技术对林下参在不同生长年限下的内参基因进行筛选，筛选出在各年限下表达均稳定的内参基因翻译延伸因子α和V-ATP，为后续林下参的分子生物学研究提供参考。吴亚运等[22]以β-微管蛋白基因作为内参基因，通过检测不同生长时期的茯苓，建立茯苓的定量扩增体系，并对该体系的模板与引物浓度、引物特异性与扩增效率进行优化，为进一步探索茯苓代谢产物合成途径奠定基础。于晓松等[23]对钩藤在不同组织、不同遮光时间和不同乙烯处理时间下β-肌动蛋白、翻译延伸因子和泛素连接酶等8个通用内参基因的表达稳定性进行分析，筛选出适用于不同条件的内参基因。结果表明，在不同组织中稳定性最好的内参基因为翻译延伸因子-1，在不同时长遮光处理后稳定性最好的内参基因为gapdh，在不同时长乙烯处理后稳定性最好的内参基因为泛素连接酶和β-肌动蛋白，综合实验结果分析，在多种表达研究时稳定性较好的内参基因为泛素连接酶。通过不同环境与不同处理因素对内参基因的筛选，此研究结果为后续钩藤药用成分基因表达分析的进一步研究提供参考依据。刘霞宇等[24-25]对忍冬不同器官及其叶片在不同温度条件下的内参候选基因进行综合分析筛选，优选出忍冬综合通用的内参基因，并综合实验结果分析推荐出在不同组织、不同温度胁迫等条件下具有稳定表达的内参基因组合；结果显示，不同温度胁迫条件下表达最稳定的内参基因为Lonja.48053，在营养器官的不同生育期中表达最为稳定的内参基因为Lonja.23932，在花器官的不同生育期中表达最为稳定内参基因为Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，忍冬所有材料中在不同时期、不同处理条件下表达均稳定的内参基因为Lonja.36369，该研究提高了忍冬植物在qRT-PCR结果中的准确性，在分子机制研究方面为忍冬基因表达差异分析奠定基础。因此筛选在各组织中表达稳定性均较好的内参基因，是后续分析功能基因表达差异的基础，也是获得真实准确的实验数据的前提[26]。

1.2 目的基因表达差异性分析 目的基因是指在实验中研究或操控的特定基因，它通常起编码产物或控制性状的作用。如植物次生代谢产物生物合成过程中起重要调控作用的酶就是由目的基因经过转录翻译等过程生成的，对于目的基因表达差异的分析能够为探究植物次生代谢的调控功能、药用植物特异性产物生物合成途径以及后续的开发利用奠定基础[27]。

目前在对目的基因的研究过程中，许多学者一般是先对其内参基因进行筛选，进而对目的基因表达量的差异性进行分析。杨林林等[28]利用qRT-PCR技术及BestKeeper、Delta CT、NormFinder等软件对狭叶柴胡不同组织中常用的内参基因进行稳定性、重复性及准确性评价。利用筛选出的内参基因β-微管蛋白对狭叶柴胡中皂苷生物合成关键酶基因的表达量进行检测。该基因在不同组织中存在不同的表达模式，对柴胡皂苷的合成与累积起调控作用。据报道，东方泽泻的主要成分为三萜类化合物，该类化合物生物合成途径的关键酶为鲨烯合酶[29]。刘青芝等[30]应用qRT-PCR技术及Delta CT等软件对东方泽泻中候选基因的表达稳定性进行分析，在不同激素处理条件下筛选出表达相对稳定的内参基因翻译延伸因子-1α、泛素连接酶和18S rRNA；并利用内参基因分析鲨烯合酶基因表达的特性。结果显示，目的基因鲨烯合酶基因在东方泽泻块茎中的表达量最高，在根中的表达量最低，这表明该基因的表达具有组织特异性，在东方泽泻的生长发育中发挥重要的调控功能。Yang等[31]对蛇足石杉在不同组织和发育阶段的基因表达情况进行分析，根据RNA-seq数据筛选出8个候选基因，用qRT-PCR技术以及NormFinder、BestKeeper、RefFinder等软件综合分析候选基因的稳定性，筛选出最稳定的2个内参基因TBP(TATA结合蛋白)和GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)。并利用参与石杉碱甲生物合成的L/ODC、细胞色素P450s基因的表达，对所选候选参考基因进行验证。结果表明，TBP基因的表达水平很低，只能在不同情况下作适当验证，GAPDH可作为在不同组织中单独用于qRT-PCR标准化的参考基因。叶友杰等[32]对巴戟天不同组织与不同处理的叶中1-脱氧木酮糖-5磷酸合成酶和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因的表达差异性进行分析，并利用筛选出的内参基因对目的基因的相对表达量进行校正，结果显示巴戟天叶中目的基因1-脱氧木酮糖-5磷酸合成酶和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的相对表达量最高，且不同处理叶中的相对表达量略高于未处理的叶，该实验结果为后续巴戟天中特异性产物合成途径的研究提供参考。

在某些药用植物中，内生真菌不仅可以通过自身刺激宿主次级代谢物质累积，对宿主植物特定功能基因的表达起诱导调控作用，还可以自身产生与宿主相同或相似的刺激代谢产物，为后续活性先导化合物的大规模工业生产提供可能[33]。如大花红景天中活性内生真菌ZPRa-R-1对红景天苷的合成累积起促进作用，内生真菌Phialocephala fortinii则在大花红景天基因及代谢途径差异基因的表达过程中发挥重要的调控功能。王梦亮等[34-35]通过对大花红景天幼苗接种ZPRa-R-1，利用qRT-PCR技术及geNorm等软件分析筛选出2个内参基因PCS(植物螯合素合酶)和GAPDH。以内生真菌ZPRa-R-1与大花红景天的相互作用为基础，利用双内参基因组合作为实验误差矫正参数，对红景天苷生物合成途径中4个关键酶UDPGT(尿苷二磷酸葡萄糖转移酶)、PAL(苯丙氨酸解氨酶)、TyDC(酪氨酸脱羧酶)和TAT(酪氨酸转氨酶)基因表达量的差异性进行分析，以不接种真菌的大花红景天作为对照，结果显示处理组中UDPGT基因的相对表达量于第8天达到峰值，后续呈下降趋势；PAL基因的相对表达量于第10天达到峰值，且呈现先升后降的趋势；TyDC基因的相对表达量呈先升后降的趋势，在第12天达到峰值，后逐渐下降至对照组以下；与对照组相比，处理组中TAT基因的表达量没有显著差异。在真菌接种于红景天之后，测得红景天苷的含量于第10天显著升高并达到最大值，后呈现下降的趋势，基本与目的基因的表达量趋势相一致，结果表明，ZPRa-R-1对UDPGT、PAL和TyDC基因表达量具有一定促进作用，同时也促进了次生代谢产物红景天苷在植物体内的累积，该实验结果为探究红景天苷生物合成关键酶基因的表达差异规律及生物合成途径提供了参考。

另外，王梦亮等[34-35]还基于内生真菌Phialocephala fortinii与大花红景天的相互影响，利用RNA转录组测序技术筛选出脂代谢、信号转导和环境适应这3条代谢途径中影响较大的PISD(磷脂酰丝氨酸脱羧酶)基因、含SNW结构域蛋白1基因(SNW1/SKIP)和病程相关蛋白1基因(PR1)等9个基因，并对以上基因的相对表达量进行分析，揭露Phialocephala fortinii对以上代谢途径中相关基因表达量的影响过程。结果显示，处理组中参与脂代谢途径基因的相对表达量与对照组基因的相对表达量相比均明显升高，其中参与甘油磷脂代谢途径基因PISD的相对表达量提高显著，在Notch信号通路中基因SNW1/SKIP与在植物激素信号转导途径中基因R1和PR2的相对表达量均显著提高；在环境适应中基因PR1、基因PR2相对表达量明显提高，结果表明内生真菌在宿主大花红景天中对脂代谢途径基因的表达起促进作用，有效提高了大花红景天的环境适应能力，为研究其他真菌与植物的相互作用发育和代谢机制过程提供参考。

基因能够决定生物体的特性，为了解药用植物中具有药理作用的特异性产物的合成机制，须深入研究基因表达的时空性与差异性等特性。只有充分了解药用植物基因表达过程中的规律，才能推动中药材特异性产物在合成生物学领域的进一步发展。

1.3 目标成分与基因表达的分析 目前，中药质量控制中常用的定量分析方法有毛细管电泳、气相色谱、高效液相色谱、液-质联用及气-质联用等方法，这些检测方法虽能够检测出中药中特征性成分的含量，但无法对其主要特征性成分进行调控与甄别[36]。如酸枣仁及其伪品滇枣仁中都含有酸枣仁皂苷，因此采用常规的检测方法无法判断中成药中投放的原料药材[37-38]，故利用灵敏度高、操作简便的荧光定量PCR技术对中药中参与目标成分合成的相关基因进行定量分析，与目标成分定量分析方法相关联，可以探究相关合成基因对目标成分的调控机制，为目标成分的来源给出相对合理的分析。

张杰等[39]采用转录组热图方法对植物中转录因子基因家族ERF的基因表达从空间和时间2个层面进行分析，根据可能参与人参皂苷调控这一因素筛选出表达较高、表达组织特异性较强的6个ERF基因(ERF1B、ERF003、ERF012、ERF026、ERF034、ERF118)。利用UPLC-MS/MS(超高效液相色谱法-串级质谱法)对用不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)处理的人参不定根中人参皂苷Rb1、Re、Rg1的含量进行检测，并使用qRT-PCR技术对MeJA处理过的人参不定根中人参皂苷合成关键基因DDS、CYP716A47、CYP716A53v2与ERF的表达进行测定。结果显示，在各处理组中DDS、CYP716A47的表达量均显著提高，其中CYP716A47的表达量随MeJA处理浓度的增加而提高，在MeJA处理后CYP716A53v2的表达量却明显下降，与原人参二醇型人参皂苷Rb1含量上升及原人参三醇型人参皂苷Re、Rg1含量下降相一致；对ERF基因的表达差异情况与DDS、CYP716A47、CYP716A53v2基因的表达特异性进行关联分析，推断出ERF003、ERF012、ERF118与CYP716A53v2存在正调控，与DDS存在负调控，可以表明ERF003、ERF012、ERF118可能通过促进CYP716A53v2表达及抑制DDS表达对人参皂苷的合成参与调控；ERF1B与CYP716A47存在负调控，可以表明ERF1B可能通过抑制CYP716A47表达对人参皂苷的合成参与调控。因此根据ERF家族中基因调控机制的不同，在生产中应该有针对性地提高正调控基因的表达量，从而提高人参皂苷的生物转化率以供应医药市场对人参皂苷的需求量。

He等[40]利用液相色谱-串联质谱对新塔花不同组织中的黄酮类化合物进行检测，并通过实时定量PCR技术和系统发育关系对其中黄酮类化合物的生物合成途径进行分析。结果显示，在检测出的12种主要黄酮类成分中，蒙花苷含量最高，且其含量在新塔花地上部分高于全草。基因表达和系统发育分析结果表明，ZbPALs、ZbCHS1、ZbCHI1和Zb4CL3参与了主要黄酮类化合物中间体的生物合成过程，ZbFLS、ZbFNSII和ZbANS分别参与黄酮醇、黄酮和花青素的生物合成过程。

Kohnen等[41]采用定性MALDI-MSI(基质辅助激光解吸电离质谱成像)、HPLC-MS(高效液相色谱-质谱)联用技术，对发育过程中茄科植物澳洲茄不同器官中的生物碱滨草碱、莨菪碱、6-羟基莨菪碱和东莨菪碱进行了定位和定量分析，采用qRT-PCR对参与东莨菪碱生物合成过程的腐胺-N-甲基转移酶(pmt)、托品酮还原酶-1(tr-l)、滨草碱变位酶(cyp80f1)和莨菪碱-6β-羟化酶(h6h)基因表达量进行定量分析。将几种莨菪烷类生物碱的空间分布结果与其数量和模式以及澳洲茄发育过程中的基因表达分析结果相结合，得出生物碱从合成部位根组织、负责运输的器官茎组织到储存器官叶子随时间变化的流动和累积过程，并绘制出完整的组织结构图。结果显示，在植物发育的各阶段，滨草碱只存在于根组织中，莨菪碱、6-羟基莨菪碱和东莨菪碱则存在于根、茎、叶各组织内。其中莨菪碱在根中含量最高，且随时间变化呈先降后升的趋势，在茎和叶组织中的含量处于较低水平；茎组织中6-羟基莨菪碱含量最高，其次是东莨菪碱，莨菪碱含量最低，三者在植物发育期间的比例不变；东莨菪碱在叶中的含量最高，且随时间变化显著升高。在植物生长过程中，pmt、tr-l和cyp80f1的转录水平在根中最高，并且pmt和tr-l的转录水平随时间呈先升后降的趋势，在12周龄植株中的表达水平达到峰值；cyp80f1的转录水平随时间变化一直呈上升趋势。h6h的转录水平在叶片中最高，且呈先升后降的趋势，在12周龄植株中的表达水平达到峰值。结果表明，莨菪碱、6-羟基莨菪碱和东莨菪碱可能作为转运形式存在于负责运输的茎组织中，在叶片中东莨菪碱则随着时间的变化而累积，实验为进一步探究澳洲茄发育过程中莨菪烷类生物碱的累积结果以及生物合成的详细过程奠定基础。基因表达对药用植物生长过程及活性物质在植物体内合成过程的影响显著，从根源出发对基因表达差异进行分析，并与活性物质的生物合成过程相关联，最终用于探究活性物质与相关基因的联系机制，为后续提高中药活性物质的生物转化率，对药用植物中主要活性物质干预调控与甄别奠定基础。

2 目的基因的鉴别

中药质量控制包括定性鉴定和定量分析，在分子定量实验过程中可利用特异性引物扩增不同样品，从而得到不同PCR产物，根据产物的熔解曲线来鉴定中药材的真伪及中药制剂的掺伪情况。Pan等[42]通过设计真鹿角、哺乳动物特异性引物和TaqMan探针，并利用TaqMan实时定量PCR技术建立鉴别真伪鹿角的方法，并对该引物与探针的特异性、线性及灵敏度进行检测。TaqMan探针在“鹿角”和“哺乳动物”DNA片段中杂交，用于监测目标基因的扩增过程。利用该方法对10批采购样品进行分析，结果显示该引物成功扩增出真鹿角DNA片段226bp、哺乳动物DNA片段146 bp，快速准确、一步到位地鉴别出真假鹿角。Hua等[43]应用Illumina-RNA-seq技术构建太子参cDNA文库，对太子参的89 857个单基因，在各蛋白质数据库(NT、NR、Swiss-Prot、COG、KEGG、Gene Ontology、Interpro)上进行BLASTx和BLASTn相似性搜索，并对所有装配单基因进行注释。根据不同产地太子参的代谢途径和表达谱，筛选出29个差异显著的单基因。利用qRT-PCR对这29个差异表达基因进行确认和分析以验证组装和注释结果。结果显示，这些基因主要参与碳水化合物代谢、脂质代谢、能量代谢、氨基酸代谢，以及其他次生代谢产物的合成过程。其中，传统产地太子参的各代谢过程及次生代谢产物的生物合成过程均显著强于栽培地的中药。

金龙胶囊主要成分为鲜守宫、鲜蕲蛇和鲜金钱白花蛇，其具有防治艾滋病、抑制肿瘤细胞等药理作用[44-46]。李晓蕾[47]以金龙胶囊作为研究对象分别对守宫、金钱白花蛇和蕲蛇建立了荧光定量PCR鉴别方法。对金钱白花蛇设计特异性引物COI37/COI337，金钱白花蛇与其伪品的荧光定量PCR鉴别结果图显示仅有金钱白花蛇样品能够生成扩增曲线和熔解曲线，说明特异性引物COI37/COI337仅对金钱白花蛇的DNA扩增；对守宫设计特异性引物对GZG1/GZG2，鉴别结果图显示仅有守宫样品生成扩增曲线和熔解曲线；对蕲蛇设计特异性引物DK1/DK2，鉴别结果图显示仅有蕲蛇样品生成扩增曲线和熔解曲线。后续对以上鉴别方法的线性、重复性进行验证，成功建立的鉴别体系为中成药的质控领域提供了新思路。叶浩婷等[48]对金龙胶囊中鲜守宫投料量建立检测方法，并对该检测方法的特异性、灵敏度和线性进行验证。结果显示，样品拷贝数的浓度比例与鲜守宫全正品、正伪品1∶1、正伪品1∶4的投料比例基本相一致。说明所建立的鲜守宫定量分析方法能有效地应用于守宫及其伪品的鉴别。利用多重连接探针扩增(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA)技术建立常见蛇类药材金钱白花蛇分子鉴定方法，对金钱白花蛇及其常见伪品赤练华游蛇、黄斑渔游蛇、尖吻蝮蛇和眼镜蛇能同时进行鉴别、区分和相对定量分析。其基于通用引物扩增的COI序列，设计了5个物种的特异性MLPA探针，该探针具有较高的特异性和灵敏度。分析表明，MLPA法可检出混合样品中5%的金钱白花蛇或8.75%的伪品，特别是根据MLPA峰面积值可推断出杂质的相对含量[49-50]。传统物理和化学鉴别方法具有局限性，对经过切片，打粉等加工制作的中药材或对已经制剂成型的中成药则无法准确进行真伪鉴定，而利用qRT-PCR建立的鉴定分析方法的实用性则更加广泛，该方法具有较好的灵敏度，对于掺伪比例较高的样品能够进行准确鉴定，未来可能在中药市场鉴定方面的应用会更加广泛。

3 小结

目前，在分析药用植物基因信息与活性成分生物合成途径和调控机制方面已取得进展[51]。药用植物在生长、发育及成熟过程中，其基因的表达在不同时期存在很大的差异。了解药用植物生长发育过程及其特异性代谢物的生物合成过程，必须要对基因表达量的差异进行分析，利用基因的差异分析进行中药真伪鉴定、道地药材的选定以及各地区同种药材差异的鉴定，已成为中药质量鉴定发展的新方向之一。qRT-PCR作为基因差异表达分析及中药真伪鉴定中的重要技术，具有高特异性、高灵敏度、线性好、快速简便且仪器自动化水平高等众多优点[52-53]。

4 讨论

qRT-PCR方法已广泛应用于药用植物基因差异表达分析[54-56]，在某些方面也存在一些不足之处值得进一步优化与改进，主要有以下几个方面：1)检测所需试剂的选择范围较小，PCR buffer等相关试剂具有一定的毒性，在当前提倡绿色发展的理念下，还有待提升；2)差异分析时对内参基因选择中有时存在一定的不准确性，可能导致在基因差异的定量研究过程中产生实验误差；3)样品制备过程中，某些标准的不统一会影响样本初始浓度而产生差异，降低定量检测结果的准确性；4)实验中所用荧光染料价格较高，一定程度上阻碍该技术的普遍应用。针对以上问题，建议以降低毒性或污染为目标开发新的实验试剂或优化现有的试剂，提高荧光染料的研制技术以缩短生产时长，增强荧光染料的稳定性以方便储存，进而可提高荧光染料的生产量，逐步降低市场价格，从而扩大qRT-PCR的应用范围。针对所选内参基因不准确这一问题，建议逐步建立内参基因库，为规范药用植物基因表达差异的研究提供准确参考；此外实验中规范样本制备步骤及储存要求，从根源上提高定量检测方法的准确性。

利用分子定量技术与内参基因分析软件筛选出各药用植物的内参基因，是药用植物功能基因的差异分析与特异性活性成分的生物合成过程分析的基础。通过对特异性产物在药用植物体内合成过程的探索，建立成熟的体外生物合成途径，不仅能缩短活性成分的产出时间，增加活性成分的产量，降低中药药品的原料成本，还能促进中药产业工业化发展进程。qRT-PCR作为误差相对较小的起始定量方法，还可结合生物芯片等先进基因技术，实现qRT-PCR与相关基因定量技术的联用，以建立更为精准的分子定量方法体系，未来在药用植物药效成分基因筛选、精准化基因定量等研究方面的应用会更加广泛。