茶树BGLU基因家族的鉴定和表达模式分析

姚新转，陈凌霄，张宝会，吕立堂

(1.贵州大学茶学院，贵阳 550025；2.贵州大学农业生物工程研究院/贵州省农业生物工程重点实验室/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵阳 550025)

茶树(Camelliasinensis(L.) O. Ktze.)是我国最具经济价值的作物之一，茶是世界三大主要饮品之一，茶中含有许多对人体有益的成分，如：氨基酸、茶多酚、咖啡碱和芳香物质等，具有调节人体精神状态，提高人体免疫力和抗菌消炎的作用。随着对茶叶的深入研究，β-葡萄糖苷酶对提高茶叶品质和茶树抗性育种的重要性不断被发掘，成为了非常热门的茶叶研究领域。

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BGLU)属于水解酶，能够催化水解芳香基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖释放。经过加热处理后的茶叶匀浆物加入β-葡萄糖苷酶会有芳樟醇、香叶醇的生成，可以推测出在茶叶中有以葡萄糖苷形式存在的芳樟醇、香叶醇的香气前体[1]。香气是决定茶叶品质的重要指标之一[2]，茶叶香型主要是栗香、青草香、清香、高香、花果香、甜香和高火香等[3-4]，茶叶含有醇类、脂类、醛类、酮类以及含氮化合物等十余类香气成分，目前已从茶叶中分离出700多种香气物质[5]，香气形成的途径主要有四个：其一，儿茶素氧化作用及类胡萝卜素经过偶联氧化降解形成醇及醛类物质组成的多种香气成分，类胡萝卜素氧化降解形成紫罗兰酮系等香气物质[6]；其二，脂肪酸过氧化及降解途径形成青叶醇、己烯醛等化合物[7]；其三，氨基酸的脱氨脱羧和美拉德反应形成醛类芳香物质[8]；最后，利用糖苷类香气前体在葡萄糖苷酶的作用下水解生成相应的醇类[9]。白茶萎凋时间比较长，这一阶段是茶叶加工中品质形成的重要过程[10]，鲜叶随着萎凋开始大量失水，茶叶中水解酶类活性提高，各种氧化还原反应和水解反应在叶片内部不断进行着，推动白茶品质的形成[11]。β-葡萄糖苷酶的活性直接影响茶叶的品质，这些物质在茶叶深加工和制药领域也起着重要的作用。

茶树生长发育过程和茶叶产量都会受到各种生物和非生物胁迫影响，如干旱、高温、寒冷等不同的逆境胁迫。在茶树的进化过程中，茶树可以感受到外界胁迫传递的信号，从而调控茶树内部酶的活性，在一定程度上抵消逆境胁迫带来的危害，因此通过挖掘这种抗性基因来提高茶叶产量和品质，增加经济价值十分关键。茶树体内可能存在含氰糖苷和含氰类脂物质，当茶树受到破坏时，经β-葡萄糖苷酶水解释放出氢氰酸，对生物胁迫和病原真菌有抗性作用[12]， 在许多植物中，BGLU基因都以基因家族的方式存在染色体中，参与细胞壁木质化、酶活性的调控、信号的传导以及激素的活化等生理过程[13-14]。在拟南芥中有48个BGLU基因[15]，在水稻中有40个BGLU基因[16]，拟南芥中的AtBGLU10可以催化产生游离的ABA，以此来提高植物的抗干旱和抗盐胁迫能力[17]，而水稻OsBGLU基因也会受到干旱和低温胁迫诱导表达[18]，说明BGLU基因在茶树的生长发育和逆境响应过程中有着很重要的作用。

通过对茶树基因组数据进行分析，从茶树基因组中鉴定到BGLU基因，并对该基因家族成员的蛋白理化性质、亚细胞定位、进化关系、染色体定位等进行生物信息学分析，同时分析了茶树BGLU家族成员在PEG诱导的干旱胁迫、茉莉酸甲酯处理、盐胁迫、冷胁迫处理中的转录组数据，为茶树BGLU家族基因机制和抗逆响应中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

在茶树基因组数据库TPIA(http://tpia.teaplant.org/)、植物基因组数据库(https://plants.ensembl.org/index.html)、拟南芥基因组数据库(https://www.arabidopsis.org/)中下载茶树、拟南芥的全基因组数据，包括基因组注释、CDS、染色体定位、蛋白结构等信息，用于茶树BGLU基因家族的生物信息学分析。

1.2 茶树BGLU基因家族的筛选与分析

利用TBtools上的BLAST功能，结合茶树基因组(http://tpia.teaplant.org)及NCBI((http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库确定BGLU基因的CDS序列、蛋白序列；将蛋白序列上传到NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在线软件分析其保守结构域；利用Expasy(https://web.expasy.org/protparam/)上的ProtParam工具预测BGLU蛋白序列的蛋白长度(Length)、分子量(MW)、等电点(PI)。从茶树基因组数据库中提取CDS、基因组DNA等信息；最后通过亚细胞定位分析软件WoLF PSORT II(https://www.genscript.com/tools/wolf-psort)预测该蛋白在细胞中的定位情况。

1.3 茶树BGLU基因结构、蛋白保守基序分析

将29个茶树BGLU基因的CDS序列输入GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)中分析其基因结构，再由MEME(http://meme-suite.org/)分析29个茶树BGLU基因的保守结构域，motif数目设置为15个，motif宽度设置6～50，利用TBtools绘制保守结构基序的图片。

1.4 茶树BGLU系统进化分析

从NCBI中下载拟南芥和茶树的BGLU基因家族蛋白序列，并利用Clustal W软件对FtsH蛋白进行多序列比对，分析BGLU基因家族的进化关系。对29个茶树和35个拟南芥的BGLU蛋白序列进行分析，在MEGA 7.0软件中采用邻接法(NJ)构建系统进化树，自展值为1 000，导出进化树结果，使用PS软件进行进化树编辑与美化。

1.5 茶树BGLU染色体定位及分布

通过对茶树基因组数据库TPIA(http://tpia.teaplant.org/)的分析，利用HMM 3.0软件中的perl 脚本从茶树的基因组中获取BGLU基因的信息，BGLU的基因名称根据其在染色体上的位置顺序进行命名。BGLU基因的染色体定位信息来源于茶树基因组数据库，利用MapInspect软件对茶树染色体上的BGLU基因进行定位。

1.6 茶树BGLU基因家族顺式作用元件分析

从茶树的基因组中寻找到BGLU基因启动子起始密码子上游的2 000 bp序列，再分别提交至在线分析软件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和SoftBerry (http://linux1.soft berry.com/all.htm) 进行启动子区域可能含有的顺式作用元件和转录起始位点的预测。

1.7 茶树BGLU基因表达模式分析

根据鉴定出的茶树BGLU基因的编号，在TPIA(http://tpia.teaplant.org)数据库下载它们在茶树不同组织(包括顶芽、嫩叶、成熟叶、老叶、花、茎、根、果)、盐胁迫、冷胁迫、PEG诱导的干旱胁迫和MeJA处理后的转录组数据(TPM值)，结果使用TBtools软件制作热图。

2 结果与分析

2.1 茶树BGLU基因家族成员鉴定及理化性质预测

通过拟南芥、茶树基因组数据BLASTP比对出来的假设CsBGLU基因提交到NCBI-CDD在线网站进行保守域的结构验证，最终得到了29个茶树BGLU基因，并根据基因在染色体的位置及其同源关系将其命名。进一步对茶树BGLU基因编码的蛋白质进行理化性质分析(表1)，结果显示，茶树最长的BGLU蛋白是CsBGLU 06，最短的蛋白是CsBGLU 29；相对分子量在11.5(CsBGLU 28和CsBGLU 29)～62.4 kD(CsBGLU 14和CsBGLU 15)；理论等电点(Pi)介于4.56(CsBGLU 27)～9.34(CsBGLU 19)之间，同时发现Pi<7的CsBGLU 蛋白达到了62.52%(19个)以上，表明大部分CsBGLU蛋白富含酸性氨基酸。BGLU基因家族成员外显子数目也不同(表2)，不同BGLU基因之间外显子数目的变化，体现了该基因受到环境影响的程度不同，经历了不一样的进化历程。根据亚细胞定位可知茶树BGLU基因大部分都定位在液泡中，而CsBGLU 28、CsBGLU 29基因定位在细胞核和液泡上。

2.2 茶树BGLU基因结构、蛋白保守基序分析

根据茶树BGLU基因组DNA序列和CDS序列提交至GSDS 2.0的结果进行基因结构分析，通过 MEME进行保守结构域分析，利用TBtools绘制基因结构、蛋白保守基序。根据图1可知，茶树BGLU家族有一定的保守性，至少有15个保守基序(Motif)，由图可知CsBGLU的基序个数由2个(CsBGLU 26、CsBGLU 27、CsBGLU 28、CsBGLU 29)到15个(CsBGLU 01、CsBGLU 02、CsBGLU 09、CsBGLU 10)，Motif 1～Motif 15广泛分布在茶树BGLU基因中， CsBGLU 10和CsBGLU 11拥有相同的保守基序， CsBGLU 14和CsBGLU 15也拥有相同的保守基序， Motif 7除了CsBGLU 17、CsBGLU 18、CsBGLU 19、CsBGLU 21、CsBGLU 23、CsBGLU 24和CsBGLU 25不存在之外在其他CsBGLU都有， Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 5、Motif 6、Motif 7、Motif 8、Motif 10、Motif 12和Motif 15分布于大部分茶树CsBGLU基因中，结果说明这些基序在茶树BGLU基因中发挥着重要的作用。

表1 茶树BGLU基因家族基因的特征Table 1 Characteristics of BGLU gene family genes in tea

2.3 茶树BGLU系统进化分析

为了研究茶树BGLU基因家族成员的分类，将47个拟南芥、35个烟草BGLU的蛋白序列与筛选得到的29条茶树BGLU蛋白，总共111个BGLU蛋白进行多序列比对并构建进化树(图2)。结果发现烟草、茶树BGLU基因在四个亚家族中都有分布，说明茶树BGLU基因和拟南芥同源性很高，BGLU基因物种分化非常保守，蛋白序列的相似性表明这两个物种的BGLU基因可能具有相似的生物学功能。根据拟南芥的同源基因分类，将拟南芥、烟草和茶树BGLU基因家族分为四个亚家族，茶树BGLU在GroupⅠ～Group Ⅳ亚家族分别有2、11、7、9个成员。

2.4 茶树BGLU基因染色体定位及分布

为了解茶树BGLU基因染色体定位分布情况，将鉴定到的29个CsBGLU基因与茶树基因组数据库TPIA比对分析，获取CsBGLU基因在染色体上的起始位置信息，利用TBtools软件绘制染色体定位(图3)。结果显示，CsBGLU 04、CsBGLU 24、CsBGLU 28基因不能定位到染色体上，其他26个CsBGLU基因都能定位到染色体上，其中Chr 7号染色体包含基因个数最多，有7个CsBGLU基因，分别是CsBGLU 10、CsBGLU 11、CsBGLU 12、CsBGLU 14、CsBGLU 15、CsBGLU 16、CsBGLU 20；而Chr 1、Chr 2、Chr 13号染色体上最少，都只有一个CsBGLU基因，分别是CsBGLU 13、CsBGLU 08、CsBGLU 17；Chr 4、Chr 9、Chr 10号染色体不含CsBGLU基因。

表2 BGLU基因家族外显子数目及占比Table 2 The exon numbers and proportion of BGLU gene family

2.5 茶树BGLU基因家族顺式作用元件分析

为探究茶树BGLU基因家族顺势作用元件情况，将鉴定到的29条CsBGLU基因利用plant CARE软件确定顺势作用元件，结果用Excel软件制作表格(表3)。结果表明，大多数CsBGLU基因还含有脱落酸、赤霉素、生长素、茉莉酸甲酯、水杨酸等激素类顺式作用元件，还有响应高温、低温、盐、干旱、冷胁迫的顺式作用元件，除此之外还有参与昼夜控制的顺式作用元件，参与分生组织表达的顺式作用元件，参与防御和应激反应的顺式作用元件，比如：有72.4%的成员含有干旱胁迫应答元件，有58.6%的成员含有脱落酸应答件，说明CsBGLU基因在参与茶树生长发育和响应非生物胁迫中具有重要的意义。

图2 茶树和拟南芥BGLU基因家族的系统进化树Fig.2 Phylogenetic trees of BGLU gene families in tea and Arabidopsis thaliana

2.6 茶树BGLU基因表达模式分析

为了解茶树BGLU基因家族的表达情况，从TPIA数据库下载它们在茶树八大组织(花、根、茎、嫩元叶、成熟叶、老叶、顶芽、果实)的转录组数据，结果使用TBtools软件制作热图(图4)。结果显示，CsBGLU在多种组织中均有表达，如：CsBGLU 01、CsBGLU 03、CsBGLU 06、CsBGLU 08、CsBGLU 09、CsBGLU 13、CsBGLU 14、CsBGLU 15、CsBGLU 20在所有组织中均具有较高的表达水平，而CsBGLU 02、CsBGLU 05、CsBGLU 17、CsBGLU 19、CsBGLU 21、CsBGLU 22、CsBGLU 27在各组织表达水平较低。同时还发现CsBGLU 14、 CsBGLU 15和CsBGLU 20在各组织中表达量较高且数值相同，而CsBGLU 24、CsBGLU 25、CsBGLU 28和CsBGLU 29在各组织中表达量较低且数值也一样。相对其他基因而言，CsBGLU 01在叶、顶芽和茎中的表达水平比在其他组织的高，并且它的表达量随着叶片的成熟度增加呈现下降趋势，但是该基因在果实表达量低。由此可见不同CsBGLU基因参与到茶树不同部位的生长过程。

图3 茶树BGLU基因的染色体位点Fig.3 Chromosome loci of BGLU gene in tea tree

图4 茶树BGLU基因在不同组织中表达模式Fig.4 The expression pattern of tea BGLU genes in different tissues

本研究对茶树BGLU基因在PEG诱导的干旱胁迫(0、24、48、72 h)、盐胁迫处理(0、24、48、72 h)平均温度达到10 ℃以上，茉莉酸甲酯处理(0、24、48 h)以及冷处理(非驯化ck;最低点，完全驯化CA 1;平均温度达到10 ℃以上，去驯化CA 3)后进行数据分析，结果显示，在干旱胁迫下，与其他基因的表达水平相比，CsBGLU 01、CsBGLU 03、CsBGLU 08、CsBGLU 14、CsBGLU 15、CsBGLU 20的表达量在0 h都较高，在24 h后受到了干旱抑制，48 h后表达量有所上升，最后在72 h下降；CsBGLU 06基因的表达量在干旱下被抑制(图5 A)。

表3 茶树BGLU顺式作用元件分析Table 3 Cis-elements analysis of tea BGLU genes

在盐胁迫处理下，CsBGLU 01、CsBGLU 03、CsBGLU 06、CsBGLU 14、CsBGLU 15、CsBGLU 17、CsBGLU 20等基因的表达量在盐胁迫下被抑制；CsBGLU 09基因受盐胁迫时表达量急剧增高，随着时间延长，在48 h和72 h慢慢下降；CsBGLU 08基因在24 h和48 h盐胁迫下都具有较高的表达量，在72 h表达量大幅度降低；CsBGLU 10、CsBGLU 11、CsBGLU 16的表达量在24 h被显著诱导上调，而在48 h和72 h时下调(图5 B)。

在茉莉酸甲酯诱导下，CsBGLU 08、CsBGLU 12、CsBGLU 14、CsBGLU 15、CsBGLU 20的表达量在12 h和24 h受到抑制，而在48 h被诱导上调，总体呈先降低后升高的趋势；而CsBGLU 17的表达水平在MeJA 处理后的12 h或24 h时诱导上调，而在48 h时受到抑制；CsBGLU 01基因在MeJA处理过程中的表达量较高，在48 h的表达量最高；同时发现CsBGLU 03、CsBGLU 06的表达量波动不大，受 MeJA 处理的影响较小(图 5 C)。

在冷处理下，CsBGLU 14、CsBGLU 15、CsBGLU 20的表达量在CA 1被小幅度诱导上调，在CA 3急剧上调；CsBGLU 08的表达量在CA 1和CA 3时都受到抑制；CsBGLU 24、CsBGLU 25、CsBGLU 28、CsBGLU 29的表达量在CA 1被抑制，在CA 3急剧上升；CsBGLU 07、CsBGLU 13、CsBGLU 23、CsBGLU 26的表达量在CA 1诱导上调，在CA 3受到抑制(图5 D)。

图5 BGLU基因在干旱(A)、盐(B)、茉莉酸甲酯(C)和冷(D)胁迫下的表达分析Fig.5 Expression analysis of BGLU gene under drought (A), salt (B), methyl jasmonate (C) and cold (D) stress

3 讨论与结论

该研究在全基因组水平上一共鉴定到29个茶树CsBGLU基因。CsBGLU基因等电点范围(PI)介于4.56(CsBGLU 27)～9.34(CsBGLU 19)之间，同时发现PI<7的CsBGLU 蛋白达到了62.52%(19个)以上，表明大部分CsBGLU蛋白富含酸性氨基酸，可能会在酸性环境下发挥重要作用。通过亚细胞定位可知BGLU基因大部分都定位在液泡上，有部分定位在细胞核。将烟草、茶树BGLU基因进行多序列比对构建系统进化树，并分为4个亚家族，由图2可知，茶树BGLU基因在4个亚家族中都有分布，说明烟草、茶树BGLU基因同源性很高；茶树BGLU基因分布在7号染色体上的基因最多，有7个；从茉莉酸甲酯、冷胁迫、盐胁迫、PEG诱导的干旱胁迫后的转录组数据得到热图了解到，当茶树受到各种胁迫时BGLU基因表达量的改变有助于发掘更多的抗胁迫基因。

茶树是多年生植物，同样是我国重要的经济作物，在茶树的生长发育中，会受到环境和人为的影响。BGLU基因在茶树生长发育和响应非生物胁迫中具有重要的作用，而目前为止对茶树BGLU基因家族的研究还未见报道，所以本研究根据生物信息学分析，了解到茶树BGLU基因广泛参与到茶树的生长发育和逆境胁迫，对茶树BGLU基因家族的每个成员进行鉴定，筛选出对胁迫具有敏感性的基因，为深入了解β-葡萄糖苷酶在提高茶叶品质和茶树抗性育种中的作用奠定了基础。