望谟地方茶树种质资源生化成分多样性分析及优异单株初筛

李 燕，徐富林，杨 春，郭 燕，郭 灿，陈正武，刘亚兵

(1.贵州省农业科学院茶叶研究所，贵阳 550006；2.望谟县农业农村局，贵州 望谟 552300)

种质资源是选育新品种和发展农业产业的基础[1-2]。优异的茶树种质资源对选育茶树良种具有重要意义[3]。地方茶树种质资源具有独特的适应性和巨大的生产潜力，是最具保存和研究价值的初级茶树种质资源，对地方茶产业发展和突出地方茶产品特色具有重要意义[4-5]。贵州地处茶树起源中心，境内蕴含类型丰富的茶树种质资源[6-7]。望谟地处黔西南，是重点产茶县，境内含大量的野生紫茶资源，素有“中国紫茶之乡”的称号[8]。望谟县“八步紫茶”野生茶树种质资源，遗传多样性较为丰富，具全株紫色和花青素含量高的特性，综合性状表现良好，含有许多符合茶产业需要且具有潜在利用价值的茶叶功能成分。经前期调查发现，望谟县境内现有“八步紫茶”野生茶树种质8万余株[9]。现望谟县大力发展紫茶产业，将茶产业作为乡村振兴的重要产业。从中选育特优异种质，对特异茶树品种选育具有重要作用，也将为望谟县紫茶产业发展提供品种基础。目前，针对望谟县地方“八步紫茶”野生茶树种质资源的收集、鉴定和评价鲜有报道，只做了部分调研工作和生物学特性调查初探，对该资源的重要功能性成分缺乏研究[10]。如何筛选优异、丰富的茶树种质资源，进而快速、准确地选育出适应望谟茶产业长远发展的茶树新品种及开发出望谟县特色优势古茶新产品是急需解决的问题。因此，开展望谟“八步紫茶”茶树种质资源功能性生化成分多样性研究，从望谟丰富的地方茶树种质资源中发掘优势特色茶树资源，以期为望谟地方茶树新品种选育提供参考，推动望谟茶产业的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂来源

20份望谟“八步紫茶”茶树种质资源(WM 01～WM 20)试验材料取自望谟县郊纳镇关鸭龙村、铁炉村、八步村、冗岩村。咖啡碱、没食子酸、儿茶素类(EGC、C、EC、EGCG和ECG)标准品购自北京世纪奥科生物技术有限公司，儿茶素类(GCG)和茶氨酸标准品购自合肥博美生物科技有限公司，乙腈、甲醇、冰醋酸等有机试剂为市售HPLC级。

1.2 试验方法

1.2.1样品制备

参考曾贞等[11]的方法，于2021年4月，按1芽2叶标准采摘春茶头轮新梢鲜叶，制备干茶茶样。

1.2.2茶汤提取

咖啡碱、没食子酸、儿茶素类(EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG)：参照GB/T 8313-2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》，采用70 ℃ 70%甲醇醇提法测定。

茶氨酸：参照GB/T 8312-2013《茶 咖啡碱测定》方法，用沸水浸提法测定。

1.2.3检测方法

参照周顺珍等[12]的方法测定咖啡碱、没食子酸、儿茶素类(EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG)含量，参照岳婕等[13]的方法测定茶氨酸含量。每个材料测定3次，取3次重复平均值。

1.2.4数据处理

试验数据基本统计和整理采用Excel 2010软件进行。相关分析、主成分分析和聚类分析采用SPSS 23.0软件进行。鉴定茶叶品质指标，参照阮宇成等[14]的方法计算儿茶素品质指数：

儿茶素品质指数=(EGCG+ECG)×100/EGC；

评价遗传多样性指数采用香农-维纳指数(Shannon-Wiener index)[15]：

H′=-∑Pi×lnPi；

式中，Pi为某性状第i个代码的频率。

参照张小琴等[16]的方法对各生化成分含量进行级数分类。按照农业行业标准NY/T 2031-2011《农作物优异种质资源评价规范 茶树》[17]对望谟20份地方茶树种质资源进行鉴定和评价，从中筛选特异资源和优良种质资源。

2 结果与分析

2.1 生化成分含量和多样性分析

茶叶的生化成分是茶类适制性的重要依据，可对茶叶品质优劣进行预判。本试验对20份望谟地方茶树种质资源的18个常规生化成分进行统计分析和多样性分析，由表1和表2可知，生化成分变异系数为0～89.77%，平均变异系数为32.73%，变异系数在50%以上的有可可碱含量、C含量、GCG含量和酚氨比。20份望谟地方茶树种质资源的酯型儿茶素含量远大于非酯型儿茶素的含量；儿茶素组分中，EGCG含量远高于其他儿茶素组分(ECG、C、EC、GCG和ECG)，平均值(8.02)超其他儿茶素组分(ECG、C、EC、GCG和ECG)平均值之和(7.12)。ECG和EGC居中，C和EC含量较低。而根据陆锦时[18]和宛晓春[19]的研究结果，一般“原始特性”野生型茶树种质资源的ECG含量较高，而EC和C的含量超过EGC的含量。因此，望谟“八步紫茶”野生茶树种质资源在生化成分上，多倾向于栽培型茶树种质资源的特征；具体表现在儿茶素组分中，EGCG的含量较高，酯型儿茶素的含量远高于非酯型儿茶素，与杨春等[20]对黎平地方茶树种质资源评价的结果一致。

表1 20份望谟地方茶树种质资源常规生化成分含量Table 1 The conventional biochemical components of 20 tea germplasm resources from Wangmo

2.1.1望谟地方茶树资源主要生化成分含量分析

20份望谟地方茶树种质资源氨基酸含量变化范围为1.60%～5.79%，氨基酸含量较高的资源为WM 18，最低的为WM 19；平均值为3.53%，变异系数为31.44%，高于广西茶树资源的3.23%[21]和福鼎大白茶的3.04%[22]。茶氨酸变化范围为0.55%～3.80%，含量最高为WM 18，最低为WM 14，平均值为1.73%，变异系数为44.47%。茶多酚变化范围为16.72%～22.27%，含量最高为WM 16，最低为WM 20，平均值为20.11%，变异系数为6.45%，分别高于广西茶树资源的13.45%[21]和福鼎大白茶的14.05%[22]。主要生化成分(氨基酸、茶多酚、咖啡碱)的平均变异系数为19.12%。没食子酸(GA)是茶叶中酚酸类化合物，极易被氧化，是重要的过氧化自由基清除剂之一，具有重要的保健作用[23-24]。其变化范围为0.01%～0.05%，含量最高为WM 04，平均值为0.02%，变异系数为47.15%。酚氨比变化范围也较大，从5.41到39.51，均值为14.74，变异系数为56.67%，其中有2份资源(WM 15和WM 18)酚氨比小于8；有5份资源(WM 05、WM 12、WM 13、WM 14和WM 19)的酚氨比大于15，剩余13份资源酚氨比介于8～15之间。表明20份望谟“八步紫茶”种质资源的生化成分含量有明显差异。

2.1.2望谟地方茶树资源儿茶素组分含量分析

儿茶素类占多酚类的70%～80%，是茶多酚类主体成分，对茶汤滋味有重要作用，是茶叶重要的保健成分，是茶树进化的重要指标之一[25]。20份望谟地方茶树种质资源儿茶素组分ECG、C、EC、EGCG、GCG和ECG变化幅度分别为1.06%～2.90%，0.11%～0.51%，0.66%～2.89%，5.13%～9.86%，0.24%～1.88%，1.46%～4.54%；平均含量分别为2.02%，0.21%，1.41%，8.02%，0.58%，2.90%；变异系数分别为22.59%、56.16%、40.24%、16.83%、58.53%和28.38%，其中C和GCG的变异系数超50%，平均变异系数为37.12%。儿茶素总量、酯型儿茶素总量、非酯型儿茶素总量变化幅度分别为11.38%～17.33%，6.92%～13.09%，2.10%～5.01%，平均含量分别为15.13%，10.91%，3.64%，变异系数分别为10.57%、13.39%和20.89%。陆锦时[18]研究表明，儿茶素品质指数对茶叶品质评价有一定意义，并认为，儿茶素指数越大，其品质越好。本试验供试种质的儿茶素品质指数变化范围为300.43～890.57，平均为571.05，变异系数为26.90%，总计有13份资源儿茶素品质指数大于500，占总数的65%。儿茶素组分和儿茶素品质指数的平均变异系数为31.67%。20份望谟“八步紫茶”种质资源的儿茶素组分差异较为明显，进一步说明其生化成分多样性较高。

2.1.3望谟地方茶树资源生物碱含量分析

茶叶中的生物碱主要为咖啡碱、可可碱和茶叶碱，也是茶汤的主要呈味物质[19]，虽在茶叶干物重中占比不大(3%～5%)，但对评价茶叶品质有重要意义。可可碱变化范围为0.50%～5.99%，含量最高的为WM 07，最低为WM 18，平均值为1.26%，变异系数为89.77%。咖啡碱变化范围为2.32%～4.56%，含量最高的为WM 03，最低的为WM 11，平均值为3.21%，变异系数为19.49%，远高于广西茶树资源的0.50%[21]和福鼎大白茶的0.16%[22]。20份供试种质的生物碱变异幅度为0～89.77%，平均变异系数为36.42%，变异幅度较大，说明20份望谟“八步紫茶”种质资源生化成分多样性较高。

2.1.4望谟地方茶树资源生化成分多样性分析

遗传多样性指数(H′)反映了茶树群体种质的丰富性，其值越大，表明各资源分布越均匀，育种潜力越大，对研究茶树群体意义重大[26]。20份望谟地方茶树种质资源的生化成分多样性指数范围为0.693～2.016，平均为1.663，其中多样性最大的为氨基酸(2.016)，最小的为茶碱(0.693)。影响茶叶品质的主要生化成分氨基酸、茶多酚、咖啡碱的多样性指数分别为2.016、1.917和1.630，平均为1.850；儿茶素组分(ECG、C、EC、EGCG、GCG和ECG)的平均多样性指数为1.695，其中C的多样性最小，为1.414，EGC的多样性最大，为1.921。生物碱组分(咖啡碱、可可碱和茶叶碱)的平均多样性指数为1.180，其中茶叶碱的最小，仅为0.693，咖啡碱的最大，为1.630。酚氨比的遗传多样性指数为1.527，儿茶素品质指数的多样性指数为1.921。这些种质资源生化成分差异较为明显，尤其在氨基酸含量上，表现出丰富的遗传多样性。

2.2 望谟地方茶树资源生化成分的主成分分析和相关分析

对16个主要生化成分进行相关性分析，结果(表3)表明，氨基酸与茶氨酸呈极显著正相关，与酚氨比极显著负相关。茶氨酸与EGC呈显著负相关，与酚氨比呈极显著负相关。茶多酚与ECG、儿茶素总量和酯型儿茶素呈极显著正相关，与酚氨比呈显著正相关。咖啡碱与EGC呈显著负相关，与EC和非酯型儿茶素呈极显著负相关，与C呈极显著正相关。EGC与氨基酸、茶氨酸、咖啡碱和C呈显著负相关，与非酯型儿茶素呈极显著正相关，与酚氨比呈显著正相关。EC与EGCG呈显著负相关，与ECG和非酯型儿茶素呈极显著正相关。EGCG与儿茶素总量和酯型儿茶素呈极显著正相关。GCG与非酯型儿茶素呈显著负相关。ECG与儿茶素总量和非酯型儿茶素呈显著正相关。儿茶素总量和非酯型儿茶素、酚氨比呈显著正相关。

表2 20份望谟地方茶树资源生化成分基本统计参数及多样性指数Table 2 The basic statistical parameters and diversity index of biochemical components in 20 tea resources from Wangmo

表3 20份望谟地方茶树资源生化成分的相关分析Table 3 The correlation analysis of biochemical components of 20 local resources from Wangmo

表5 各类群中的主要生化成分Table 5 The major biochemical components in each group

主成分分析可以很好地简化研究性状，更好地研究和评价群体[27]。用SPSS软件对20份望谟地方茶树种质资源的13个主要生化成分(除茶碱含量)进行主成分分析，以特征值大于1为标准提取主成分，结果(表4)显示，这4个主成分的累积贡献率为77.901%，第1主成分的贡献率为31.113%，对应特征向量中作用较大的几个性状为：氨基酸、茶氨酸、茶多酚、咖啡碱、EGC、儿茶素总量，特征向量值均在0.6以上，其中氨基酸、茶氨酸和咖啡碱的影响为负值。第2主成分的贡献率为20.446%，对应特征向量中作用较大的几个性状为：EC和EGCG，其中EC为负值，且特征向量值均在0.8以上。第3主成分的贡献率为16.569%，对应特征向量中以茶多酚、ECG和儿茶素总量作用最大，特征值均在0.5以上。第4主成分的贡献率为9.773%，对应特征向量中以C最大，为负值，其次是GA，特征值均在0.5以上。根据这4个主成分可以反映望谟地方茶树种质资源的大部分信息。

2.3 聚类分析

对13个生化成分(除茶叶碱含量)进行系统聚类分析。如图1所示，在欧氏距离为15时，可将该20份种质资源分成三大类，第1类包括9份资源，为WM 02、WM 06、WM 03、WM 01、WM 08、WM 17、WM 20、WM 15和WM 18；第2类包括10份资源，为WM 05、WM 12、WM 19、WM 04、WM 10、WM 09、WM 13、WM 16、WM 07和WM 11；第3类包括1份资源，为WM 14。

以主要的6个生化成分(氨基酸含量、茶氨酸含量、茶多酚含量、酚氨比、咖啡碱含量和儿茶素总量)在不同类群中的表现进行统计分析(如表5)，结果表明，第1类群的氨基酸含量、茶氨酸含量、咖啡碱含量平均较高，第2类群平均值居中，第3类群平均值较低；第3类的茶多酚含量、酚氨比和儿茶素总量最高，第2类群的居中，第1类群的最低。

表4 20份望谟地方茶树资源生化成分的主成分分析Table 4 The principal component analysis of biochemical components of 20 local resources in Wangmo

表6 茶树资源优异生化成分含量Table 6 Tea resources with high biochemical components

图1 20份望谟地方茶树种质资源基于主要生化成分的聚类分析Fig.1 Twenty tea germplasm resources in Wangmo based on cluster analysis of main biochemical components

2.4 优异资源鉴选

生化成分含量对筛选茶树种质资源具有重要意义，生化成分含量优异的种质资源，是选育优良茶树品种的潜在资源[28]。根据NY/T 2031-2011《农作物优异种质资源评价规范 茶树》和已有的相关文献对优异茶树种质资源的各生化成分的定义标准[29-31]。由表6可知，从20份望谟地方茶树种质资源中鉴选出特异资源7份，其中高茶氨酸资源1份，为WM 18；高GCG资源1份，为WM 15；高氨基酸资源5份，分别为WM 01、WM 02、WM 06、WM 15和WM 18。茶多酚含量≥20%的潜在优良资源14份，分别为WM 01、WM 03、WM 04、WM 05、WM 06、WM 07、WM 09、WM 10、WM 12、WM 13、WM 14、WM 16、WM 18和WM 19。EGCG(≥9.0%)的潜在资源4份，分别为WM 04、WM 07、WM 12、WM 14和WM 16。儿茶素总量>17.0%的种质资源3份，分别为WM 07、WM 14、WM 16。酯型儿茶素>12.0%的种质资源5份，分别为WM 04、WM 07、WM 10、WM 16。这些资源均可作为茶树品种选育的潜在重要资源。

2.5 适制性预判

酚氨比对评价茶树种质资源适制性有重要作用，可以作为茶树资源适制性的初筛指标[32]。一般适制绿茶的酚氨比小于8，适制红茶的酚氨比大于15，红绿兼制的酚氨比为8～15[33]。本研究中的望谟“八步紫茶”种质资源中适制绿茶的有3份，分别是WM 02、WM 15和WM 18；红绿兼制的有11份，分别为WM 01、WM 03、WM 04、WM 06、WM 08、WM 09、WM 10、WM 11、WM 16、WM 17和WM 20；适制红茶的有6份，分别为WM 05、WM 07、WM 12、WM 13、WM 14和WM 19，其中酚氨比最大的为WM 14(39.51)。

3 讨 论

3.1 望谟地方茶树种质资源生化成分多样性分析

本研究通过对20份望谟“八步紫茶”种质资源的生化成分多样性进行分析，发现望谟“八步紫茶”资源的生化成分变异系数差异较大，变异幅度为0～89.77%，与莫岚等[34]对广东连南的茶树种质的研究结果相似，均是可可碱的变异系数最大(146.39%)，但又远远小于连南可可碱的变异系数。平均变异系数为32.73%，小于黎平县地方茶树种质资源[20]，小于重庆30份种质资源[35]；大于贵州贵定鸟王种茶树等众多贵州种质资源[15-16,29-30]，大于武夷名丛茶树资源[36]。遗传多样性指数范围为0.693～2.016，平均为1.663，与贵定鸟王种(1.69)[16]和贵州野生茶树种质(1.82)[15]相近，高于贵州镇宁(0.87)[29]，低于杭州(1.99)[28]；常规的3种生化成分(氨基酸、茶多酚和咖啡碱)，以氨基酸变异系数最大(31.44%)，茶多酚变异系数最小(6.45%)，咖啡碱居中(19.49%)，这一结果与张小琴等[16]对贵定鸟王种的生化成分多样性分析的研究结果(氨基酸最大、咖啡碱最小、茶多酚居中)有所不同，与刘声传等[15]、王新超等[21]、曹雨等[29]的研究结果一致，且氨基酸的变异系数大于广西地方茶树种质资源(25.6%)[21]和贵州镇宁野生茶树种质资源(24.87%)[29]，低于贵定鸟王种(35.97%)[16]、云南(50.30%)[36]和广东连南(34.73%)[33]的种质资源。茶多酚的变异系数均小于贵州镇宁、广西、广东连南和贵州贵定鸟王种的。说明望谟“八步紫茶”地方种质资源的变异较为丰富，且供试各种质的茶多酚含量变化较其他地方稳定，氨基酸含量变化居中，较广西地方和贵州镇宁的变异大，较云南、广东连南和贵定鸟王种稳定；主要生化成分的变异较黎平和重庆的稳定。

3.2 望谟地方茶树种质资源生化成分演化分析

研究表明，生化成分含量与茶树进化层次有关。一般随着茶树从野生型进化到栽培型，生化成分更为丰富，氨基酸含量增加，儿茶素总量增加，非酯型儿茶素减少，酯型儿茶素增加等[37]。在本研究中，氨基酸含量平均值为3.53%、比广西茶树资源(3.23%)[21]和广东连南资源(3.04%)[33]、贵州镇宁野生茶树资源(1.8%)[29]、贵州野生茶树资源(2.21%)[15]，低于贵定鸟王种(4.05%)[16]，福鼎大白茶(4.0%)[22]，与陈正武等[30]对28份贵州茶树资源(野生、半野生、地方品种)研究结果(3.66%)相近，小于武夷名丛资源(3.82%)[35]，大于贵州地方茶树资源(群体品种资源)的3.3%[39]。由此说明望谟地方茶树种质资源按照氨基酸的变化，其更接近栽培型。儿茶素总含量平均为15.13%，与陈正武等[30]的研究结果(15.14%)相近，小于贵州镇宁野生茶树种质的16.70%[29]，略大于广东连南茶树种质资源(15.03%)和贵州黎平地方茶树种质资源(14.43%)[20]。说明望谟茶树种质资源介于栽培型和野生型之间，较黎平茶树资源更倾向于野生型，较贵州镇宁野生茶树种质资源更倾向于栽培型。望谟地方茶树种质资源的酯型儿茶素总量平均含量为10.91%，高于广东连南茶树种质资源(11.87%)[33]，高于贵州野生茶树种质(10.67%)[15]，低于陈正武等[30]研究的28份贵州茶树资源(野生、半野生、地方品种)(11.70%)。非酯型儿茶素总量平均含量为3.64%，低于广东连南茶树种质资源(3.16%)[33]，高于贵州野生茶树种质(2.65%)[15]，高于陈正武等[30]研究的28份贵州茶树资源(野生、半野生、地方品种)(3.45%)。从酯型儿茶素和非酯型儿茶素含量变化也进一步说明望谟地方茶树种质资源介于栽培型和野生型之间。根据上述讨论结果可认为，望谟“八步紫茶”地方茶树种质资源的结果介于栽培型和野生型之间。

3.3 望谟地方茶树种质资源的挖掘利用

目前，因产业发展的实际需要，望谟“八步紫茶”地方茶树种质资源大多利用茶树群体进行扦插繁育，没有经过提纯和相关单株鉴定和选育，导致种质性状混杂极其严重，不利于加工和品质提升，优异资源未得到充分利用。本研究经聚类分析将20份望谟“八步紫茶”地方茶树种质资源分为3类，且初步筛选出特异资源7份，其中高茶氨酸(≥3.0%)资源1份，高GCG(>1.5%)资源1份，高氨基酸(≥4.5%)资源5份。此为第一次在望谟“八步紫茶”茶树种质资源中筛选出优异和潜在利用资源。茶氨酸既是茶树重要的次代谢产物，又是呈味物质，同时还兼具保健功效[40]。高茶氨酸资源的鉴选对选育高茶氨酸品种具有积极作用，也是开发高茶氨酸茶和高GABA茶的重要资源。杨春等[20]、赵洋等[41]、方开星等[42]分别从贵州黎平地方茶树种质资源、保靖黄金茶资源和广东种质资源库中的218份茶树种质资源中鉴选出总共16份高茶氨酸资源。这些高茶氨酸资源均可为生产高品质绿茶提供资源基础。氨基酸对茶叶绿茶品质提高具有积极作用，具鲜甜味，对绿茶鲜爽度提高具有积极作用。一般认为，氨基酸含量越高，绿茶滋味鲜爽度越好[19,43]。本试验初筛的高氨基酸资源可为高品质贵州绿茶提供基础，也为深加工和功能性茶产品开发利用提供品种原料。GCG为EGCG的空间异构体，较EGCG稳定，具有较强的自由基清除活性，且具有较强的抑制黑色素形成的能力[44-45]。本试验筛选的高GCG资源将为自由基清除、黑色素抑制和相关保健品开发与研究提供依据。

望谟茶树种质资源丰富，本试验随机检测了其中20份资源，进行了初步的筛选、收集和保存，但尚未进行系统的选育研究。需更进一步扩大资源量进行筛选和对初步筛选的种质进行系统评价和品种选育，以满足望谟县紫茶产业的需要，进而推进贵州特色茶产业发展。

4 结 论

望谟地方茶树资源生化成分上具丰富的遗传多样性，该资源表现出栽培型茶树的特点，从中初步筛选出适制绿茶茶树资源3份，红绿兼制的有11份，适制红茶的有6份。生化成分含量特异的资源7份(高茶氨酸资源1份、高氨基酸资源5份、高GCG资源1份)；潜在优良资源21份，其中茶多酚含量大于等于20%的14份，儿茶素总量大于17.0%的种质资源3份，酯型儿茶素大于12.0%的种质资源4份。这些资源可为贵州茶产业发展提供品种来源。也可为茶树功能性成分提取提供材料来源，为茶叶深加工提供材料基础，具有重要的科研和生产价值。