肾细胞癌患者外周血T淋巴细胞表面PD-1水平及临床意义

林 锋，张 黎，王彩燕

厦门大学附属第一医院血液科，福建厦门 361003

肾细胞癌(RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，肾透明细胞癌约占所有RCC的80%，是RCC最常见的组织学类型[1-2]。由于RCC对常规的放疗、化疗不敏感，近年来，对RCC患者进行免疫靶点的治疗成为临床研究中的热点。T淋巴细胞作为抗肿瘤免疫的主要细胞已被用于RCC的治疗[3]。程序性死亡受体-1(PD-1)作为一种重要的免疫抑制分子，当T淋巴细胞表面的PD-1受体与肿瘤细胞表面的程序性死亡配体-1(PD-L1)结合后，会抑制T淋巴细胞杀伤肿瘤的作用[4]。既往有研究表明RCC患者中PD-1高表达能够导致免疫抑制性肿瘤微环境形成，使肿瘤细胞逃避机体免疫监视，不利于RCC患者的预后[5-6]。增殖细胞核抗原Ki-67是一种反映细胞增殖活性的核蛋白抗原，通过激活细胞周期蛋白依赖激酶2/细胞周期蛋白E通路，加速G1/S期的进程，促进细胞增殖，Ki-67已被证实可作为多种肿瘤细胞的增殖标志物[7]。本研究通过流式细胞术检测患者外周血T淋巴细胞及其表面PD-1的水平情况，结合增殖细胞核抗原Ki-67水平，分析RCC患者的免疫状况，以期用灵敏、高效的方法为RCC患者的早期诊断及预后提供可靠依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2021年4月至2022年5月于本院初诊为RCC的42例患者(RCC组)的临床资料，其中男35例，女7例；年龄13～82岁；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期3例；病理分级：Ⅰ～Ⅱ级33例，Ⅲ～Ⅳ级9例；病理类型：透明细胞癌33例，其他类型9例(包括未分类RCC 5例、嫌色细胞癌1例、肾母细胞癌1例、乳头状细胞癌2例)；肿瘤位置：左肾18例，右肾24例；选取同期45例体检健康者作为对照组，其中男32例，女13例，年龄18～69岁。本研究符合《赫尔辛基宣言》，并获得本院医学伦理委员会批准，受试者均知情同意。

1.2仪器与试剂 所用荧光单克隆抗体：FITC标记CD4、PE标记CD8；检测仪器、检测软件及数据分析采用美国BD公司的FACSCantoⅡ流式细胞仪、Diva 自动上机软件。

1.3方法

1.3.1一般资料收集 记录所有RCC患者的性别、年龄、临床分期、病理分级、肿瘤最大径、位置和增殖细胞核抗原Ki-67的水平，分析外周血T淋巴细胞水平及T淋巴细胞表面PD-1水平与临床病理特征的关系。

1.3.2T淋巴细胞比例及其表面PD-1水平检测 清晨采集受试者空腹静脉血3 mL于含肝素钠抗凝剂的采血管中，处理前充分混匀。在流式管底部加入10 μL PD-1检测试剂，吸取100 μL混匀的外周血标本，加入管底，避免标本碰到管壁上部；轻轻涡动混匀，室温避光反应15 min；向管内加入2 mL 1×溶血素，轻轻涡动混匀，室温避光孵育10 min；300×g离心5 min，弃上清液；向管内加入 2～3 mL磷酸盐缓冲液，涡动混匀，300×g离心5 min，弃上清液；向管内加入0.5 mL磷酸盐缓冲液并完全混合，上机检测。采用FSC/SSC双参数设门，获取1×105个淋巴细胞，根据淋巴细胞膜上CD分子水平的不同，流式细胞仪可以分辨出各种不同的细胞，并计算出CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+。

2 结 果

2.1两组T淋巴细胞比较 与对照组比较，RCC组CD8+T淋巴细胞百分比升高，CD4+/CD8+降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；两组CD4+T淋巴细胞百分比比较，差异无统计学意义(P=0.20)。见表1。

表1 两组T淋巴细胞比较

2.2两组T淋巴细胞表面PD-1水平比较 与对照组比较，RCC组CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞表面PD-1水平明显升高(P<0.05)，见表2。

表2 两组T淋巴细胞表面PD-1的水平比较

2.3外周血T淋巴细胞表面PD-1水平与患者临床病理特征的关系 RCC患者中，外周血T淋巴细胞表面PD-1的水平与患者的年龄、性别、病理分级、临床分期、肿瘤最大径、肿瘤位置、病理类型均无关(P>0.05)，而与组织中Ki-67水平有关，Ki-67水平≥10%的患者外周血T淋巴细胞表面PD-1水平高于Ki-67水平<10%的患者(P<0.05)。见表3。

表3 外周血T淋巴细胞表面PD-1水平与患者临床病理特征的关系

续表3 外周血T淋巴细胞表面PD-1水平与患者临床病理特征的关系

3 讨 论

肿瘤微环境中炎症细胞的浸润和免疫分子的调节对肿瘤的发生、发展至关重要，肿瘤微环境包括由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞在内的肿瘤浸润淋巴细胞组成[8]。RCC被认为是一种免疫原性肿瘤，肿瘤微环境中免疫细胞浸润是RCC预后的重要因素[9]。目前关于RCC免疫功能的研究不多且说法不一，有研究报道RCC肿瘤组织中CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的高度浸润与肿瘤较高的分级和较短的患者生存期有关[10]。有研究表明，增加CD4+肿瘤浸润T淋巴细胞的数量，联合抗PD-1治疗能够缓解RCC患者病情[11]。因此，深入研究RCC患者的免疫细胞及免疫检查点对RCC的诊断治疗意义重大。本研究结果表明，RCC组外周血CD8+T淋巴细胞百分比较对照组明显升高，CD4+/CD8+较对照组明显降低，RCC患者外周血中存在T淋巴细胞水平失衡，提示RCC患者处于免疫抑制状态。

PD-1属于免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜蛋白，为CD28/细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4/诱导性共刺激分子受体家族的成员，主要表达于肿瘤浸润T淋巴细胞表面[12]。近年来研究发现，PD-1除了可以在肿瘤组织表达外，还以可溶性形式存在于外周血中[13]。由于肿瘤组织标本来源困难不能实现多次检测，动态观察的目的，因此，通过检测肿瘤患者外周血PD-1水平反映患者的免疫状态至关重要。本研究发现，RCC组外周血T淋巴细胞表面PD-1水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。通过对RCC患者PD-1水平的多次动态监测，有助于临床医生对患者病程进展、治疗方案及效果做出及时准确的评估。

Ki-67作为一种评价细胞增殖的核抗原，其水平指数可以独立预测癌症的进展。既往研究认为Ki-67在RCC患者中的预后预测价值较高，高水平Ki-67的RCC患者具有较高的临床病理分级及较短的生存期[14]。Ki-67可促进肿瘤细胞增殖，而过快的肿瘤细胞增殖可促进肿瘤微环境中糖酵解产生的乳酸堆积，从而致使调节性T淋巴细胞上的PD-1水平升高[15]。本研究结果表明，Ki-67水平≥10%的患者外周血T淋巴细胞表面PD-1水平高于Ki-67水平<10%的患者(P<0.05)，预示着二者联合检测能更好地预测RCC的进展和分期。Ki-67通过参与细胞周期调控来促进肿瘤增殖，而PD-1/PD-L1轴可通过磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路调节肿瘤细胞的增殖、分化[16]。因此，PD-1与Ki-67对肿瘤细胞的增殖调控是否存在潜在联系值得进一步探讨。

综上所述，RCC患者外周血中存在CD8+T淋巴细胞百分比升高，CD4+/CD8+降低；RCC组PD-1水平的升高与肿瘤组织中Ki-67水平有关。外周血T淋巴细胞及其表面PD-1水平检测可以更好地帮助判断RCC患者的免疫状态及预后。但本研究存在一定的局限：RCC组的临床分期Ⅲ～Ⅳ期数量太少，一定程度上影响统计结果；期待后期大样本研究能更好地呈现外周血T淋巴细胞表面PD-1水平与患者临床病理特征的关系。