GLP-1受体激动剂及其类似物减缓骨质疏松作用的研究进展

谢保城 徐永祥 胡润凯 陈占玲 丁少波

(南方医科大学附属东莞医院 1药学部，广东 东莞 523000；2内分泌科)

目前，随着生活水平的改善，高脂肪饮食摄入增多，导致糖尿病的发病率持续上升，高血糖及其所致的各种并发症严重影响患者的生活质量。糖尿病基础上合并骨骼系统损害的全身代谢性骨病称为糖尿病性骨质疏松，是糖尿病导致的严重并发症之一〔1〕。糖尿病患者易发生骨矿含量减少、骨密度降低的情况，但由于早期临床症状不明显而易被忽略。骨质疏松已成为糖尿病患者致骨折、致残的重要原因〔2〕。胰高血糖素样肽(GLP)-1受体激动剂因其独特的作用优势，在降糖及减重领域的市场份额越来越大。自2005年艾塞那肽被美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市以来，多种 GLP-1 受体激动剂都陆续上市。研究发现，GLP-1及其类似物通过结合GLP-1受体(GLP-1R)以发挥降血糖作用〔3〕。近年来有临床研究发现，GLP-1受体激动剂及其类似物可以显著改善糖尿病患者的骨代谢，促进成骨分化，发挥抗糖尿病性骨质疏松作用，且细胞水平和动物实验进一步发现，GLP-1受体激动剂及其类似物对绝经后骨质疏松、糖皮质激素性骨质疏松和老年性骨质疏松均具有较好的抗骨质疏松作用〔4,5〕。但不同的GLP-1受体激动剂及其类似物可能有着不同的分子作用机制。本研究对GLP-1受体激动剂及其类似物减缓骨质疏松作用的研究进展进行综述。

1 GLP-1受体激动剂及其类似物的生物学功能

GLP-1是一种由小肠L细胞分泌的内源性肠促胰岛素激素。内源性的GLP-1存在 2 种主要活性形式，分别为 GLP-1(7-36)酰胺和 GLP-1(7-37)。与传统治疗糖尿病药物相比，GLP-1可作用于胰岛α及β细胞来发挥降血糖、调节体内葡萄糖稳态的作用。其作用主要包括：促进胰岛素相关基因转录，刺激胰岛素的合成与分泌；促进胰岛β细胞的增殖和新生；抑制胰岛β细胞的凋亡；抑制胰高血糖素的分泌。同时可以促进肝脏、骨骼肌和脂肪组织的合成代谢，舒张血管、降低血压，抑制胃肠道蠕动和胃液分泌、延迟胃排空等作用。GLP-1通过结合GLP-1R以发挥其生物学作用。GLP-1R属于7次跨膜G蛋白耦联受体B家族中的胰高血糖素受体亚家族，广泛分布于胰腺、脑及骨等组织和器官〔6〕。在临床实践中，GLP-1受体激动剂能够模拟GLP-1的生物学活性和功能，被广泛用于糖尿病患者的治疗。目前，已上市GLP-1 激动剂药物主要有利拉鲁肽(liraglutide)、艾塞那肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽和索马鲁肽等〔7〕。近年来的研究发现，GLP-1 受体激动剂不仅可以促进胰岛素分泌、控制血糖，还可通过多种途径影响机体骨代谢，起到预防和治疗骨质疏松的作用。

2 GLP-1受体激动剂及其类似物对骨质疏松的作用

2.1GLP-1受体激动剂及其类似物对糖尿病性骨质疏松的作用 糖尿病合并骨质疏松是临床常见的糖尿病并发症，属于继发性骨质疏松。糖尿病性骨质疏松的发生发展机制复杂，主要是：(1)高血糖状态，糖尿病性骨质疏松患者过多的葡萄糖会经尿液中排出，引起渗透性利尿，导致机体内钙、磷排除增加，血液中钙浓度降低，会激活破骨细胞活性和增殖，骨吸收增强，骨量减少。同时机体长期高血糖状态会抑制成骨细胞的增殖分化，促进破骨细胞分化，破骨细胞分化增多，可能是糖尿病性骨质疏松的主要发病机制〔1〕；(2)胰岛素缺乏，机体胰岛素可促进合成代谢、维持血糖浓度稳态的作用。胰岛素的缺乏或者敏感性下降会影响到成骨细胞活性改变，骨吸收及骨形成的平衡破坏，骨吸收大于骨形成，最终导致骨密度下降，形成骨质疏松。(3)晚期糖基化终末代谢产物(AEGs)大量生成，会诱导白细胞介素-6、肿瘤坏死因子等炎性介质增加，增加破骨细胞活性；同时，AGEs不断蓄积会使骨基质中的Ⅰ型胶原变硬，增加骨脆性，导致骨质疏松〔1,8〕。(4)不同种类的降糖药，有证据表明，降糖药物对骨代谢的影响较大，患者服用噻唑烷二酮类(TZD)类降糖药物后，骨折发生率反而升高。目前，临床上治疗主要以限制患者的饮食，控制血糖，加强日常锻炼，补充钙剂及维生素，使用骨形成促进剂和骨丢失抑制剂等综合治疗。已有研究发现，GLP-1受体激动剂其类似物具有缓解糖尿病性骨质疏松的作用〔9〕。Yamada等〔10〕通过建立GLP-1受体基因敲除GLP-1R(-/-)小鼠模型，研究GLP-1在骨代谢调节中的作用。研究结果与对照组相比，GLP-1R(-/-)模型组小鼠皮质骨骨密度下降、骨脆性增加、破骨细胞数量和骨吸收活性增加。同时发现GLP-1R(-/-)模型组小鼠骨吸收指标尿脱氧吡啶啉升高和降钙素mRNA转录水平降低。表明GLP-1受体与骨质疏松密切相关。Cheng等〔11〕，评估GLP-1受体激动剂与T2DM患者骨折风险之间的关系，结果发现与安慰剂和其他抗糖尿病药相比，GLP-1受体激动剂利拉鲁肽和利西拉来肽与骨折风险降低有关，其有益效果取决于治疗的持续时间。Zhang等〔12〕，分析GLP-1受体激动剂对2型糖尿病患者骨折风险的影响。荟萃分析表明，与使用安慰剂或其他抗高血糖药的2型糖尿病患者相比，GLP-1受体激动剂与降低的骨折风险相关，并且艾塞那肽在治疗2型糖尿病所致骨折的风险最低。王春雷等〔13〕研究GLP-1对糖尿病大鼠模型骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化能力的影响。结果发现BMSCs中存在GLP-1受体，并且GLP-1可促进糖尿病大鼠模型中BMSCs向成骨细胞分化并调节Wnt通路部分基因的表达及骨保护素/核因子(NF)-κB受体活化因子配体/NF-κB受体活化因子(OPG/RANK/RANKL轴的动态平衡。Zhang等〔14〕进一步研究利拉鲁肽和维达立汀对骨代谢的影响，结果发现利拉鲁肽能显著降低小鼠的AEGs和甲状旁腺激素(PTH)，提示利拉鲁肽可改善骨代谢，起到缓解骨质疏松作用。

2.2GLP-1受体激动剂及其类似物对绝经后骨质疏松作用 绝经后骨质疏松主要绝经期后妇女由于雌激素缺乏，导致骨量减少及骨微结构退化，使骨脆性增加，易于骨折的一种全身性骨骼疾病。近年来发现，GLP-1受体激动剂在治疗绝经后骨质疏松方面效果显著。Lu等〔15〕研究GLP-1受体激动剂利拉鲁肽对卵巢切除(OVX)诱导绝经期后骨质疏松大鼠的骨密度的影响和对BMSCs的成脂和成骨分化的影响。结果显示，利拉鲁肽可改善OVX大鼠股骨骨小梁体积、厚度和数目、增加骨密度、减少骨小梁间距。同时利拉鲁肽可以增加Runt相关转录因子(Runx)2和Ⅰ型胶原蛋白表达。结果表明抗糖尿病药物利拉鲁肽对OVX诱导绝经期后骨质疏松大鼠具有骨保护作用。同时Ma等〔4〕研究艾塞那肽对OVX诱导的绝经期大鼠骨质疏松的影响。艾塞那肽给药16 w后，显著增强骨强度，防止骨小梁微结构的恶化，同时提高血清碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)表达水平。综合以上研究发现，GLP-1受体激动剂对OVX大鼠具有抗骨质疏松作用，提示GLP-1受体激动剂是治疗老年绝经后骨质疏松的潜在候选药物。

2.3GLP-1受体激动剂及其类似物对老年性骨质疏松的作用 老年骨质疏松是原发性骨质疏松，其特点是骨微观结构改变、骨密度降低、骨强度下降。老年骨质疏松已成为老年妇女和男性的一个重要公共卫生问题，因为它会导致骨折、残疾和较高的社会经济成本。Zhang等〔16〕采用衰老的成骨细胞模型评估了艾塞那肽4的抗骨质疏松作用。艾塞那肽4是一种强效GLP-1受体激动剂。研究结果表明，GLP-1受体激动剂艾塞那肽4上调骨代谢基因(OPG、RANKL、BGP)表达，下调衰老相关基因(p16、p21、p53)表达，可能激活IGF-1/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路，促进衰老成骨细胞增殖，从而预防老年骨质疏松。王宁等〔17〕进一步研究艾塞那肽对老龄大鼠骨质疏松的防治作用。研究结果显示，艾塞那肽可以显著增加老龄大鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度、碱性磷酸酶、骨钙素等骨质疏松相关指标，说明艾塞那肽对老龄大鼠骨质疏松具有明显的防治作用。

2.4GLP-1受体激动剂及其类似物对糖皮质激素性骨质疏松的作用 糖皮质激素性骨质疏松(GIOP)主要是患者在使用糖皮质激素治疗疾病过程中引起的骨量快速丢失，以骨量减少、骨微结构破坏、骨强度下降为特征的一种疾病〔18,19〕。糖皮质激素过量会导致骨脆性增强，是患者发生骨折的高风险因素。GIOP 在各种骨质疏松中发生率较高且多数患者不易发现，症状隐匿。患者长期使用糖皮质激素治疗会导致骨骼矿物质密度下降并引发骨折的风险，高危人群应尽早开始骨保护治疗〔20,21〕。研究发现，GLP-1受体激动剂及其类似物栀子苷可通过激活 GLP-1受体缓解地塞米松所致成骨分化的抑制，增强成骨分化的活性发挥抗GIOP作用〔22〕。提示GIOP与胰岛素分泌和 GLP-1受体之间有着密切关系。随后 Yang等〔5〕研究利用利拉鲁肽对糖皮质激素诱导的骨质疏松大鼠模型中骨代谢标志物的影响，结果发现利拉鲁肽治疗后，骨密度、骨微结构和骨生物力学指标均得到明显改善。提示GLP-1受体激动剂及其类似物具有抗GIOP作用。

3 GLP-1受体激动剂其类似物减缓骨质疏松的相关机制

3.1GLP-1受体/丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信号通路 有MAPK属于丝/苏氨酸蛋白激酶，主要包括细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)1/2，c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)，p38 MAPK和ERK5，主要通过级联效应将信号从表面受体传导至细胞核内部，ERK1/2磷酸化激活会由胞质转位到细胞核内，进而介导转录激活因子ETS样蛋白(ELK)-1、激活蛋白(Ap)-1、原癌基因蛋白(c-fos)和c-Jun等转录活化，参与细胞增殖与分化、细胞骨架的构建、细胞凋亡等多种生物学反应。研究发现，ERK MAPK信号通路在骨质疏松方面发挥着重要的作用。本课题组研究发现，ERK抑制剂U0126和GLP-1受体拮抗药艾塞那肽9-39能抑制栀子苷诱导的 ERK的活化并抑制了栀子苷对糖皮质激素所致成骨分化抑制的作用，表明GLP-1受体激动剂及其类似物栀子苷可以通过GLP-1受体激活ERK MAPK信号发挥抗GIOP作用〔22〕。Feng等〔23〕研究GLP-1受体激动剂艾塞那肽对小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖，分化和矿化的影响，表明艾塞那肽增加ALP、胶原蛋白Ⅰ、OC和Runx2表达，进一步研究发现艾塞那肽上调ERK1/2，p38和JNK的磷酸化，使用选择性MAPK抑制剂，PD98059，SB203580，SP600125可以阻断艾塞那肽对ERK1/2，p38和JNK MAPK信号通路的激活及细胞增殖和分化。提示艾塞那肽可能通过激活MAPK途径促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖和分化。

3.2GLP-1受体/PI3K/Akt信号通路 PI3K-AKt信号通路调控各种不同细胞功能包括细胞代谢、生长、增殖、存活、转录及蛋白质合成的各个方面。Wu等〔24〕研究发现MC3T3-E1中存在GLP-1R，并证明利拉鲁肽可促进成骨细胞增殖，在各个阶段上调成骨细胞生物标志物的表达并刺激成骨细胞矿化。研究发现利拉鲁肽提高细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平和Akt磷酸化，用PI3Kα/δ/β的抑制剂LY294002和沉默GLP-1受体处理细胞可部分阻断利拉鲁肽诱导的信号激活，并减弱利拉鲁肽对MC3T3-E1细胞的促进作用。利拉鲁肽能够通过GLP-1受体激活PI3K/Akt，cAMP/PKA作用于成骨细胞，促进成骨分化。

3.3Wnt/β-catenin通路 Wnt/β-catenin 信号通路在调节细胞的增殖、凋亡及组织的修复方面发挥重要作用，同时能够促进间充质干细胞及成骨细胞的增殖及分化，增加细胞的活性和促进成骨分化。Meng等〔25〕研究证明，GLP-1受体激动剂艾塞那肽通过激活GLP-1受体促进成骨分化，艾塞那肽通过调节PKA/β-catenin和PKA/PI3K/Akt/糖原合成酶激酶(GSK)-3β信号促进骨髓间充质干细胞成骨分化。Wu等〔24〕研究发现，利拉鲁肽会增加β-catenin水平并且增加核内β-catenin含量和转录活性，进一步沉默β-catenin后可以部分阻断利拉鲁肽诱导的信号激活，并减弱利拉鲁肽对MC3T3-E1细胞的促进作用。提示利拉鲁肽能够通过GLP-1受体激活β-catenin作用于成骨细胞，促进成骨分化。

3.4OPG/RANKL/RANK通路 RANKL是连RANK的一种分泌型破骨细胞形成抑制因子，二者结合后被激活，导致NF-κB 转移至细胞核内，促进破骨细胞成熟。研究表明，OPG与RANKL在破骨细胞发育的终末阶段和维持机体骨代谢平衡发挥重要作用。OPG/RANKL/RANK通路在破骨细胞分化和调节骨代谢过程中的一个重要信号传导通路〔26〕。Ma等〔4〕研究发现，艾塞那肽不仅抑制骨吸收增加OPG/RANKL比值，发挥抗老年OVX大鼠骨质疏松作用。

4 小分子化合物调控GLP-1受体发挥抗骨质疏松作用

目前，已经上市的GLP-1受体激动剂均为多肽类制剂，大分子蛋白，需要皮下注射，很大程度限制了其被广泛应用且患者依从性差，患者更愿意选择口服药物治疗。因此，口服GLP-1受体激动剂已成为糖尿病新药研究的热点。其中，寻找到有效的小分子GLP-1受体激动剂具有巨大的应用前景，和大分子GLP-1受体激动剂相比，小分子GLP-1受体激动剂分子量小，可以口服，避免皮下注射，而且服药不受饮食和剂量的限制，将提高患者的用药依从性。辉瑞开发的首个小分子GLP-1受体激动剂Danuglipron (PF-06882961)率先完成1期临床试验，结果表明Danuglipron能够降低2型糖尿病患者的血糖水平，还能减轻糖尿病患者体重〔27〕。这可能成为替代注射制剂和其他口服制剂的新的治疗选择。本课题组初步的研究发现Danuglipron具有促进MC3T3-E1细胞成骨分化的作用。已发现的小分子GLP-1受体激动剂栀子苷可以通过介导MC3T3-E1细胞中的GLP-1R/ABCA1轴改善地塞米松诱导的大鼠骨小梁微结构损伤和细胞分化抑制，降低地塞米松诱导的胆固醇积累，增强细胞分化〔28〕。同时也有研究发现一种基于喹喔啉的小分子化合物DMB可以激活GLP-1受体，并且研究采用OVX建立骨质疏松小鼠模型，OVX 小鼠腹腔内给予DMB， 结果发现DMB 主要通过诱导骨形成来改善骨丢失，表明该小分子化合物可用于治疗绝经后骨质疏松〔29〕。提示小分子GLP-1受体激动剂在骨质疏松治疗中具有较好的应用前景。

综上，GLP-1受体激动剂及其类似物可能成为治疗糖尿病性骨质疏松药物，同时GLP-1受体激动剂及其类似物在绝经期后骨质疏松和糖皮质激素性骨质疏松等同样具有良好的应用前景。它能增加骨量、骨小梁和骨皮质厚度、增强骨强度和影响骨胶原；可以通过影响骨细胞释放的激素从而发挥其对骨代谢的调节作用；不同的GLP-1受体激动剂及其类似物可能有着不同的分子作用机制。但以上研究多为细胞实验和动物实验研究数据，缺乏临床数据，今后尚需更大样本和更长期的临床研究来证实GLP-1受体激动剂及其类似物对骨代谢的影响并探讨其确切机制。