长链非编码RNA在膀胱癌发生发展中研究进展

关欣 杨利强 徐伟杰 武煜明

(昆明卫生职业学院，云南 昆明 650600)

膀胱癌是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤〔1〕。近年来膀胱癌的发病率和病死率均呈逐年上升趋势，严重威胁我国国民的健康〔2〕。膀胱癌大致可以分为两类：非浸润性和浸润性膀胱癌。在新发膀胱肿瘤患者中70%～80%为非肌层浸润性膀胱癌，尽管接受了积极的手术及化学治疗，膀胱癌还是具有较高的复发率和转移率，并且有10%～30%患者进一步发展成肌层浸润性膀胱癌〔3，4〕。肌层浸润性膀胱癌预后能力较差，患者 5年生存率低于50%〔5〕。因此，明确膀胱癌发生发展的分子生物学机制，寻找膀胱癌的有效的治疗靶点显得至关重要。长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子。大量研究表明，lncRNA可以通过影响信号转导通路、表观遗传调控、细胞增殖分化等多个层面参与生物体内的多种调控过程〔6，7〕。本文就lncRNA在膀胱癌发生发展及治疗过程中的作用研究进展作一简要综述。

1 LncRNA的概述、分类及功能

1.1LncRNA的概述 目前发现的大多数lncRNA都是由RNA聚合酶(pol)Ⅱ或RNA pol Ⅲ转录产生〔8〕。LncRNAs转录本由多个外显子组成，与编码蛋白质的mRNA的结构类似,具有3＇poly A尾巴和5＇帽子结构，但与mRNA相比，lncRNA转录本的外显子更少，总体表达水平较低，而且种间的序列保守性差，只有5%～6%的lncRNA具有保守序列〔9〕。LncRNA广泛存在于真核生物体内，早期研究过程中认为lncRNA是“转录噪音”，不具有生物学功能〔10〕。然而，近年来研究发现，lncRNA虽然不能参与蛋白质编码，但其在染色质修饰、基因转录后调控、核内运输、细胞周期等发育过程中发挥着重要的调控作用〔10～12〕。LncRNA的这些调控作用可能参与了疾病的发生发展，与疾病的诊断治疗密切相关，使其成为了生物学研究热点之一。

1.2LncRNA的分类与功能 目前尚未有明确规范的lncRNA的分类方法，最常见的主要是根据lncRNA在基因组中与邻近编码蛋白基因组之间的位置关系进行划分，可以将其分为5种类型：①基因间lncRNA：lncRNA由位于两个蛋白质编码基因的间隔区域，与蛋白编码基因相距至少1 kb以上转录本转录得到；②基因内lncRNA：lncRNA从蛋白质编码基因的内含子区域转录形成；③双向lncRNA：lncRNA由相邻的蛋白质编码基因的启动子反方向转录而来；④反义lncRNA：由编码基因反方向转录形成，转录本与编码基因的外显子存在重叠区域；⑤正义lncRNA：由编码基因同方向转录形成，转录本与编码基因的外显子存在重叠区域〔13〕。LncRNA的功能与其在基因组中的定位密切相关。 绝大多数lncRNA定位在细胞核中，参与染色质修饰、转录激活、募集RNA pol Ⅱ等调控过程；少数lncRNA定位在细胞质，通过影响mRNA的稳定性、参与翻译调控及竞争性结合microRNA来调节生物学功能〔14，15〕。

LncRNA的亚细胞定位呈现多样化，在细胞核、细胞质中均有分布，甚至有些独特的lncRNA具有独特的亚细胞定位，所以lncRNA在生物体内的功能也非常复杂。目前确定的主要有以下8种功能〔16，17〕：①在编码蛋白基因上游启动子区域进行转录，影响下游基因的表达水平；②通过抑制RNA pol Ⅱ活性或参与染色质重组及组蛋白修饰，影响下游基因的表达；③通过与编码蛋白基因的mRNA形成互补双链，干扰mRNA的剪切，从而形成不同的剪切形式；④通过与编码蛋白基因的mRNA形成互补双链，进一步在Dicer酶作用下形成内源性的siRNA,从而调控基因的表达水平；⑤lncRNA通过与特定的蛋白质结合，影响蛋白多聚物的形成，调控蛋白活性；⑥作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；⑦lncRNA通过结合到特定蛋白质上，改变其细胞的定位；⑧lncRNA作为小分子竞争性结合microRNA，抑制其与mRNA的结合，使得mRNA免于降解。研究发现，在许多恶性肿瘤中，lncRNA的表达和功能常常存在异常〔18〕。这些异常的lncRNA通过在基因表观遗传调控、转录调控及转录后调控参与到肿瘤细胞的增殖、转移和浸润等发生发展过程〔19〕。这些研究提示lncRNA可能成为癌症早期诊断的特异性生物分子标志物和治疗靶点。

2 LncRNA在膀胱癌中的作用

随着lncRNA研究的深入，其在疾病发生发展过程中的作用也越来越受大家的关注。在前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌等常见肿瘤中，都发现了异常表达的lncRNA，研究结果也证实这些表达异常的lncRNA确实与肿瘤的增殖、迁移、侵袭等发生发展过程密切相关〔20～22〕。在泌尿系统肿瘤研究中，也发现了多种异常表达的lncRNA参与了肿瘤发生发展，其中发现最早的是在膀胱癌中表达异常的H19，之后又陆续发现了UCA1、MALAT1等在膀胱癌中的作用〔23～25〕。因此，不断阐明新的lncRNA在疾病发病机制中的作用对临床诊断、治疗等方面均具有重要的价值。

2.1LncRNA对膀胱癌细胞增殖的影响 癌症的发生发展受多种因素的调控，如环境、遗传等，其中细胞增殖调节的失控是肿瘤发生发展的一个重要机制。细胞发生异常增殖，造成细胞凋亡减少，会促进肿瘤的发生。许多关于膀胱癌和lncRNA的研究表明，lncRNA参与了膀胱癌细胞的增殖调控。

LncRNA H19是最早发现的在膀胱癌中异常表达的长链非编码RNA。H19位于人染色体11p15.5上，全长2.3 kb，是母源性印迹基因，在胚胎发育时期呈现高表达水平，而出生后表达水平快速降低〔26〕。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)对24例膀胱癌组织、癌旁组织及膀胱癌细胞系的H19表达水平进行检测分析，发现膀胱癌组织和膀胱癌细胞系的H19呈高表达水平，并且过表达H19可以通过调节分化抑制因子(ID)2和果蝇zeste基因增强子同源物(EZH)2蛋白的表达促进膀胱癌细胞的增殖〔27〕。Luo等〔28〕研究也证实H19通过与EZH2相结合，可以激活Wnt/β-链蛋白信号通路，从而抑制上皮细胞E-钙黏附素(cadherin)的表达促进膀胱癌增殖、转移。尿路上皮癌相关抗原(UCA)1是参与膀胱癌发生发展过程中特异性表达的lncRNA，其在膀胱癌组织中呈现高表达，并与膀胱癌的增殖密切相关。研究发现，lncRNA UCA1的表达水平与环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)表达量呈正相关，过表达UCA1可以通过调控细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活性和表达，激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)信号通路,从而调控p300 和CREB的表达，最终促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。LncRNA在肿瘤中的功能并不是单一的，有促癌作用也有抑癌作用。母系表达基因(MEG)3就是少数发挥抑癌作用的lncRNA之一。采用RT-qPCR对31例膀胱癌组织和对应的癌旁组织进行监测分析，发现在膀胱癌组织中MEG3表达水平明显下调〔29〕。此外体外实验结果显示，在 T24细胞中对MEG3做敲除处理，使MEG3表达缺失会增加膀胱癌细胞的增殖，而重新表达MEG3则可抑制肿瘤细胞的增殖和集落的形成，更重要的是自噬抑制可以抵抗MEG3下调造成的细胞增殖〔29〕。MEG3在膀胱癌中具有抑癌功能，但其发挥作用的机制仍不明确，需要进一步的研究探讨。

2.2LncRNA对膀胱癌细胞侵袭和转移的影响 恶性肿瘤的发展进程常伴有肿瘤细胞的侵袭和转移，而这也是造成肿瘤患者死亡及难以治疗的主要原因。以往研究证实，表达异常的lncRNA可能参与了肿瘤细胞的侵袭和转移调控过程。目前已被研究报道的lncRNA MALAT-1、UBC1、MDC1-AS、SNHG7、ncRNA、UCA1等〔30～32〕与膀胱癌的侵袭、转移密切相关。LncRNA MALAT-1是一个在膀胱癌、肝癌、前列腺癌等癌症中都高表达的特异性lncRNA。在膀胱癌的研究中发现，MALAT-1在癌组织中的表达量明显高于癌旁组织，与没有发生转移病灶的膀胱癌组织相比，发生转移的膀胱组织中MALAT-1呈现高表达。体外研究证实，在膀胱癌细胞株T24和RT4中通过调节转化生长因子(TGF)-β表达水平上调MALAT-1和SUZ12的表达，从而激活Wnt信号通路促进细胞发生上皮间质转化(EMT)，进而增强了膀胱癌细胞的侵袭、迁移、转移能力〔33〕。另外，He等〔34〕发现lncRNA UBC1在膀胱组织中的表达水平明显高于癌旁组织，且UBC1的表达与淋巴结的转移及较差的预后密切相关。研究表明，UBC1在原发性膀胱癌中表达水平升高，并且其表达水平越高，膀胱癌患者发生淋巴结转移的概率越大〔35〕。通过RNA免疫沉淀发现UBC1可以与多梳抑制性复合物(PRC)2的核心成分EZH2和SUZ12相互结合，从而促进膀胱癌细胞增殖、转移和侵袭〔34〕。以上研究都表明lncRNA的异常表达与肿瘤发生进程的增殖、侵袭和转移具有高度的相关性，这也提示了我们更加深入研究lncRNA在癌症发生过程中的作用及机制，可以为肿瘤治疗和干预提供一定的基础和方向。

3 LncRNA在膀胱癌诊断和治疗中的作用

膀胱癌良好治疗的基础是可能患膀胱癌人群的早期筛查诊断和有效且无创的术后监测方法。膀胱镜检查虽然是膀胱癌诊断的金标准〔36〕，但其有创性的特点，常令患者望而生畏，且膀胱镜无法发现早期、较小的膀胱癌病变，因此无法用于膀胱癌高危人群的早期筛查。尿液细胞学检查是临床应用最为广泛的无创检查方法，但其敏感性较低，可重复性较差〔37〕。目前研究最多的膀胱癌标志物是核基质蛋白(NMP)22〔38〕和膀胱肿瘤抗原(BTA)〔39〕系列试验,但均存在特异性较低的问题。这些方法无法满足目前临床早期诊断和术后监测膀胱癌的需要。因此，确定更好的、可靠的、无创的、可用于早期诊断和术后监测的膀胱癌标志物非常重要。

在膀胱癌中，有些lncRNA不仅与肿瘤的发生发展密切相关，而且在诊断、预后方面具有高度的敏感性和特异性。研究发现，通过尿液细胞学检测发现尿液中UCA1显示其在膀胱癌诊断中具有明显的特异度(91.76%，78/85)和灵敏度(80.85%，76/94)，而且UCA1与膀胱癌的分期分级密切相关，膀胱癌的分级越高，UCA1诊断的灵敏度也越高，在膀胱癌G2～G3期患者中灵敏度高达91.11%(41/45)〔40〕。在膀胱癌患者尿液中UCA1所表现出来的高特异度和灵敏度，使其可能成为膀胱癌诊断及治疗预后评估的肿瘤标志物。还发现UBC1在膀胱癌中的表达与肿瘤的淋巴结转移、术后生存率呈负相关。提示UBC1也可作为膀胱癌高风险患者加强治疗和预后评价的一个指标。另外，Wang等〔41〕在膀胱癌患者血清外泌体中关于lncRNA H19的研究结果也表明，膀胱癌患者血清外泌体中H19与癌旁组织中的H19表达水平呈正相关，且与术前样本相比术后样本中的血清外泌体H19显著降低，膀胱癌患者血清外泌体H19表达水平也显著高于健康人群。生存曲线分析也表明膀胱癌患者血清外泌体H19表达水平与患者生存率呈负相关，以上结果都提示我们血清外泌体H19可以作为膀胱癌非侵入性诊断和治疗预后监测的标志物。

HOX反义转录RNA(HOTAIR)是位于12号染色体上由HOXC基因簇的反义链转录而来的lncRNA。研究发现，HOTAIR在宫颈癌中表达上调，并且与肿瘤的大小、淋巴转移、浸润深度相关，而且上调的HOTAIR还可以作为宫颈癌预后评估的有效分子标志物〔42〕。在甲状腺癌中，也发现HOTAIR通过激活Wnt信号通路影响甲状腺癌患者的肿瘤大小、淋巴转移并且和肿瘤患者较差的存活率有明显的关系〔43〕。另外，在原发性肿瘤患者和淋巴结转移患者的唾液中检测发现HOTAIR表达量有明显的差异。唾液 HOTAIR检测被认为是无创、快速诊断口腔癌的标志物。HOTAIR不仅在宫颈癌、甲状腺癌、乳腺癌、口腔癌等肿瘤中可作为分子标志物，在膀胱癌中HOTAIR表达水平对膀胱癌发生发展、复发和预后情况也具有明显的预测价值。HOTAIR表达水平与膀胱癌复发率呈正相关，其中Ta/T1级膀胱癌复发率较高。在Ta/T1级膀胱癌组织切片中通过免疫组化检测发现Wnt-抑制因子(WIF)-1表达水平与 HOTAIR呈负相关，由此可见HOTAIR可作为Ta/T1级膀胱癌复发率的独立预测指标〔44〕。

综上，膀胱癌和其他肿瘤一样，其发生发展是一个动态多变的过程。近年来关于膀胱癌的诊断、治疗虽然出现了一些新方法，但是对于早期的诊断、术后的监测等问题还是未能作出建设性的突破。随着科技技术的发展，关于lncRNA在膀胱癌中的研究成果也越来越多，大量的研究也表明lncRNA与膀胱癌的增殖、迁移、侵袭等生物进程密切相关，这也使lncRNA有可能成为膀胱癌早期诊断、治疗、复发监测的潜在分子标志物。虽然当前已经发现了较多与膀胱癌相关的lncRNA,但其在组织中特异性低，而且在其他肿瘤中也呈现异常表达，这为我们开发膀胱癌特异性强，灵敏度高的lncRNA分子标志物提供了难度。因此，我们应该更加深入的研究探讨lncRNA在膀胱癌发生发展中作用，才能更好地预测、诊断膀胱癌及为膀胱癌个性化治疗和药物研发提供具有意义的理论指导。