基于网络药理学探讨益肾清肝方逆转乳腺癌内分泌治疗耐药机制

桂越蓉，王烁，董军，周彤，王丹丹，侯炜

中国中医科学院广安门医院，北京 100053

全球癌症统计最新数据显示，2020年乳腺癌新发病例230万例（11.7%），已超过肺癌成为全球发病率最高的恶性肿瘤；死亡68.5万例，为全球第五大癌症死亡原因[1]。2020年我国乳腺癌新发病例约42万例，发病率居全球第一，死亡约11.7万例，居女性恶性肿瘤死亡首位[2]。70%～80%乳腺癌患者表达雌激素受体（estrogen receptors，ER），内分泌治疗（endocrine therapy，ET）已成为ER阳性乳腺癌患者主要且有效的治疗方式[3]。有研究发现，在晚期ER阳性乳腺癌患者中，仅有20%～40%对一线ET方案有效，其中约50%在治疗8～14个月后因ET耐药而发生复发及转移[4]。因此，逆转乳腺癌ET后继发耐药，提高乳腺癌对ET的敏感性，继而防止耐药后肿瘤复发转移，是临床亟待解决的难题。

近年来，中医药在逆转化疗耐药方面显示出一定的优势，已有研究显示，中医药能逆转顺铂、阿霉素（ADR）等化疗耐药，提高其抗肿瘤活性[5-6]。乳腺癌患者在ET期间，由于药物干预雌激素功能发挥，出现类更年期症状，本院林洪生教授认为该阶段的中医病机以肾虚为本，患者还表现出烘热汗出、烦躁易怒、头晕耳鸣、心悸失眠、筋急骨痛等症状，为肝火内扰之象，故确立了乳腺癌ET期间以益肾清肝为主的治疗大法。益肾清肝方是林洪生教授以丹栀逍遥散为主加减治疗乳腺癌ET耐药的临床经验方，结合既往研究成果组方而成，药用白芍、丹参、柴胡、牡丹皮、当归、苦参、山萸肉、泽泻、熟地黄、栀子，临床实践显示该方有不同程度的抑制肿瘤生长、延缓耐药、提高机体免疫功能等功效，但其作用机制尚不清楚。本研究基于网络药理学和分子对接探索益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药的潜在靶点与可能机制，为该方的应用提供实验研究基础。

1 资料与方法

1.1 益肾清肝方活性成分及靶点筛选

通过TCMSP数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[7]分别检索益肾清肝方组方药物白芍、丹参、柴胡、牡丹皮、当归、苦参、山茱萸、泽泻、熟地黄、栀子的化学成分，时间截至2021年7月24日。根据TCMSP的ADME参数[8-9]，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为标准，筛选具有较高活性的化合物。在相关靶点（related targets）搜索栏过滤出活性成分对应的靶蛋白，借助UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）[10]查询靶蛋白所对应的人类基因名称。

1.2 乳腺癌内分泌治疗耐药相关靶点检索

以“Breast cancer resistance to endocrine therapy”为关键词，检索GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），获得乳腺癌ET耐药的原始基因表达谱数据（GSE67916）[11]。该数据包括4个对他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞系（TamR MCF7/S0.5）TamR1、TamR4、TamR7、TamR8及1个对他莫昔芬敏感的乳腺癌细胞系MCF7/S0.5，分析了2种细胞系的差异基因表达谱（基因芯片平台GPL570）。将耐药株设置为试验组，敏感株设置为对照组，进行GEO2R分析。导出全部分析结果，以P＜0.05、logFC＞1或logFC＜-1为筛选阈值，获得乳腺癌ET耐药相关差异表达基因。

1.3 蛋白相互作用网络构建及核心靶点筛选

将筛选得到的药物靶点与疾病差异基因分别去重，然后取交集得到共同靶点，为益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药的潜在作用靶点。登录STRING11.5数据库（https://string-db.org/）[12]，选择“multiple protein”模式，上传活性成分与疾病的交集靶点，物种选择“Homo sapience”，设置最低相互作用阈值“medium confidence（0.400）”，隐藏网络中的游离节点，下载tsv文件，导入Cytoscape3.8.2构建蛋白相互作用（PPI）网络，根据节点度值筛选益肾清肝方逆转ET耐药的关键靶点。

1.4 GO和KEGG通路富集分析

将药物与疾病的交集靶点导入Metascape基因功能注释分析工具（https://metascape.org/）[13]，进行GO和KEGG通路富集分析。物种输入选择“Homo sapience”，设定富集的统计显著性“P Value Cutoff=0.01”，获得益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药潜在靶点的主要基因功能及参与的信号通路。将富集结果按P值升序排列，分别对GO富集的前10位条目和KEGG富集的前20位条目进行可视化展示。将KEGG富集的前20条通路所包含的靶点及活性成分导入Cytoscape3.8.2构建靶点-活性成分-通路网络。

1.5 分子对接

将益肾清肝方逆转ET耐药的主要活性成分与关键靶点进行分子对接，以验证成分与靶点之间的结合活性。检索蛋白质晶体数据库PDB和PubChem，得到靶点与活性成分的三维及化学结构，使用PyMOL软件对蛋白质分子进行去水、去磷酸根等操作，利用AutoDock Tools 1.5.6将化合物与靶点蛋白pdb格式转为pdbqt格式并寻找活性口袋，最后运行AutoDock Vina 1.2.0进行对接。一般认为，结合能＜-4.25 kcal/mol表示配体小分子与受体蛋白之间有一定的结合活性，结合能＜-5.0 kcal/mol表示二者之间有较好的结合活性，结合能＜-7.0 kcal/mol表示成分与靶点具有强烈的结合活性[14]。

2 结果

2.1 益肾清肝方活性成分、靶点及乳腺癌内分泌治疗耐药靶点

通过TCMSP数据库获得益肾清肝方中药物1 375个化学成分（白芍85个，丹参202个，柴胡349个，牡丹皮55个，当归125个，苦参113个，山茱萸226个，泽泻46个，栀子98个、熟地黄76个），按OB≥30%、DL≥0.18标准共筛选出活性化合物176个，包括白芍13个，丹参65个，柴胡17个，牡丹皮11个，当归2个，苦参45个，山茱萸20个，泽泻10个，栀子15个，熟地黄2个，26个为共有成分。176个候选化合物中，124个可以在TCMSP数据库中匹配到共2 615个人类靶点，去重后最终得到254个。通过在GEO数据库中对MCF7耐药株和敏感株的差异基因表达谱进行分析，共获得差异表达基因1 857个（见图1），去除重复后获得1 467个乳腺癌ET耐药相关靶基因。

图1 乳腺癌ET耐药差异表达基因火山图

2.2 交集靶点蛋白相互作用网络

将药物靶点和ET耐药相关靶点取交集共得到30个共同作用靶点。将交集靶点导入STRING平台生成PPI网络，利用Cytoscape3.8.2进行可视化（见图2）。该网络包含28个节点、158条边。其中度值、介数大的靶点预测是益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药的关键靶点，前8位关键靶点拓扑参数见表1。

图2 益肾清肝方与乳腺癌ET耐药交集靶点PPI网络

表1 益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药关键靶点拓扑参数

2.3 GO和KEGG富集分析结果

将益肾清肝方逆转ET耐药的交集靶点导入Metascape平台进行GO和KEGG富集分析。GO分析得到生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）各418、33、39条。取P值排名前10位的条目，进行可视化分析（见图3）。其中生物过程主要包括细胞成分运动的正向调节（positive regulation of cellular）、生殖结构发育（reproductive structure development）、生殖系统发育（reproductive system development）、对细胞因子的反应（response to cytokine）、对 荷 尔 蒙 的 反 应（response to hormone）等。

图3 益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药靶点GO富集分析

KEGG富集分析共得到114条信号通路，对前20条信号通路进行可视化展示（见图4）。益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药涉及多条信号通路，主要包括FoxO信号通路（FoxO signaling pathway）、P53信号通路（P53 signaling pathway）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）等。

图4 益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药靶点KEGG通路富集分析

2.4 活性成分-靶点-通路网络

将KEGG富集的前20条通路所涉及的活性成分及靶点导入Cytoscape3.8.2软件，构建靶点-活性成分-通路网络（见图5）。该网络共有56个节点、193条连线，包含靶点25个、益肾清肝方活性成分11个。按度值降序排列，活性成分的拓扑参数见表2。

图5 益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药活性成分-靶点-通路网络

表2 益肾清肝方核心活性成分拓扑参数

2.5 分子对接结果

将益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药的前8个关键靶点分别与主要活性成分进行分子对接。分子对接结果显示结合能均小于0，表明益肾清肝方活性成分与关键靶点之间均存在结合活性，且所有活性成分分别与MAPK1、PGR、MAPK8关键靶点之间具有强烈的结合活性，结合能均小于-7.0 kcal/mol，其中PGR与活性成分之间的结合活性最佳（见图6）。

图6 益肾清肝方核心活性成分与关键靶点分子对接热图

3 讨论

益肾清肝方中牡丹皮、栀子、当归、白芍、柴胡取丹栀逍遥散之意，养血柔肝、滋肝阴、泻肝火。有研究显示，丹栀逍遥散能有效改善乳腺癌患者ET后类更年期综合征，且不影响性激素水平[15-16]。方中熟地黄、山萸肉滋肾益肝，泽泻、牡丹皮利湿泄热，四药合用，一补一泻，取六味地黄丸之意，肝肾阴并补，以滋肾阴为主，契合乳腺癌ET期间的病机；丹参一味功同“四物”，生血活血，行血而不伤正，以通为补，能间接起到补益作用。研究表明，隐丹参酮能抑制细胞膜上乳腺癌耐药蛋白（BCRP）寡聚物的形成，从而阻断药物流出，使乳腺癌细胞对化疗敏感[17]。课题组既往研究表明，苦参提取物氧化苦参碱能抑制MCF7细胞的体外成球能力，体内能抑制乳腺癌肿瘤干细胞（BCSCs）荷瘤裸鼠的成瘤能力，而BCSCs是导致乳腺癌耐药的主要原因之一[18]。以上均奠定了益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药的基础。

本研究结果显示，益肾清肝方逆转ET耐药的主要活性成分为β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、槲皮素、豆甾醇、苦参碱、隐丹参酮、儿茶素等，可能在乳腺癌ET耐药中发挥重要作用。β-谷甾醇是一种广泛存在于植物种子和果实中的天然植物固醇，其在体外能对多种肿瘤细胞产生增殖抑制作用[19]。Awad等[20]研究显示，β-谷甾醇与他莫昔芬联合使用能在体外显著抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的生长，其机制可能与β-谷甾醇刺激丝氨酸棕榈酰转移酶活性，从而增强细胞生长和神经酰胺（CER）促进的凋亡信号相关。BCSCs自我更新与上皮间质转化（EMT）在乳腺癌ET耐药及耐药后的侵袭转移中发挥重要作用[21]。有研究显示，木犀草素可能通过下调乳腺癌细胞β-catenin的表达、抑制BCSCs的自我更新，进而抑制EMT过程，降低人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT549细胞的侵袭和迁移能力[22]。腺苷三磷酸结合（ABC）亚家族蛋白成员是目前已知在肿瘤化疗耐药中发挥重要作用的蛋白家族成员[23-24]。有研究显示，山柰酚与ADR联合用药后，可以降低ADR在MCF7耐ADR细胞（MCF7/ADR）中的IC50值，诱导MCF7/ADR细胞凋亡，其机制可能与山柰酚降低ABC亚家族蛋白成员ABCB1蛋白表达有关[25-26]。槲皮素是一种天然存在的具有良好生物活性的植物化学物质，对多种癌细胞系具有杀伤活性[27]。有研究显示，在槲皮素作用下，他莫昔芬对耐药细胞的增殖抑制和凋亡效应呈剂量递增趋势，提示槲皮素可能具有逆转乳腺癌细胞对ET的耐药性[28]。但由于槲皮素水溶性差、体内代谢快、半衰期短，导致生物利用度低，从而限制其在医药上的应用[27]。苦参碱是从苦参中提取的一种活性碱，能通过降低AKT的磷酸化，调节PI3K-Akt信号通路诱导的细胞凋亡，抑制MCF-7/ADR细胞的生长，逆转乳腺癌的多药耐药[29]。隐丹参酮是从丹参中提取的一种脂溶性蒽醌类衍生物，有良好的抗炎、抗氧化及抗肿瘤活性[30]。Ni等[17]研究显示，隐丹参酮能以ERα依耐性和非依耐性的方式抑制BCRP活性，增加乳腺癌对化疗的敏感性。儿茶素是一种黄烷醇类化合物，具有明显的抗癌活性。研究显示，儿茶素及其衍生物能通过抑制ABC转运蛋白P-gp、ABCB1介导的药物外排，将细胞内药物浓度恢复至细胞毒水平，增强细胞对药物的敏感性[31]。以上均说明益肾清肝方的主要活性成分可能通过下调ABC转运蛋白表达、抑制BCSCs自我更新、抑制PI3K-Akt等信号通路等机制发挥逆转耐药作用。

本研究通过PPI网络对益肾清肝方的核心靶点进行了预测，结果显示ESR1、TP53、STAT3、MAPK1、PGR等可能是益肾清肝方治疗乳腺癌ET耐药的关键靶点。雌激素受体α基因（ESR1）突变是导致乳腺癌ET耐药最常见的原因，ESR1突变将引起ER活性提高和ER表达上调，甚至产生不依赖雌激素的自发活性[32]。研究显示，接受内分泌治疗后，15%～30%的乳腺癌患者会出现ESR1配体结合区域的突变，ESR1突变将缩短后续使用芳香化酶抑制剂类药物治疗患者的无进展生存期，从而产生ET耐药[33]。TP53是一种重要的抑癌基因，大约30%的乳腺癌患者含有TP53基因的体细胞突变，超过80%的三阴性乳腺癌患者存在TP53点突变或缺失[34-35]。TP53突变可导致化疗耐药，与乳腺癌患者治疗反应差和生存率下降有关[36-37]。肿瘤干细胞（CSCs）自我更新是癌症进展和化疗耐药性的重要机制之一。Wang等[38]研究显示，STAT3能通过上调BCSCs中肉碱棕榈酰转移酶1B（CPT1B）等编码脂肪酸β-氧化关键酶（FAO）表达，促进BCSCs自我更新和乳腺癌化疗耐药，而抑制STAT3可下调CPT1B基因表达，阻断BCSCs自我更新，恢复乳腺癌对化疗的敏感性。MAPK1，也称为ERK2，是Ras/Raf/ERK通路的主要成员，该通路在肿瘤细胞中过度激活，参与肿瘤细胞的增殖和恶性转化，在某些肿瘤中，该通路的表达会通过调节药物泵和抗凋亡分子参与肿瘤化疗抵抗[39]。如Raf异常表达会使乳腺癌细胞中MDR-1药物泵和抗凋亡蛋白Bcl-2的水平升高，参与乳腺癌耐药[40]。孕激素受体（PGR）在临床上被用作ER转录活性的生物标志物，是内分泌反应的有效调节剂。有研究显示，当PGR在N末端氨基酸残基Ser294上磷酸化时，会增强Her2信号通路、胚胎和CSCs生物学行为，增强乳腺癌内分泌抵抗[41-42]。

核心靶点GO富集分析显示，生物过程主要涉及细胞成分运动的正向调节、生殖结构发育、生殖系统发育、对细胞因子的反应、对荷尔蒙的反应等。其中，对荷尔蒙的反应可能是参与ET耐药的主要生物过程，而细胞成分运动的正向调节则在耐药后复发转移中发挥重要作用。KEGG通路富集分析显示，益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药与多条信号通路有关，主要包括FoxO信号通路、P53信号通路、雌激素信号通路、PI3K-Akt信号通路等。FoxO转录因子是肿瘤抑制因子，其活性抑制在许多肿瘤的恶性行为中发挥中重要作用。有证据显示，抑制FoxO通路将促进激素非依耐性乳腺癌生长的许多特征，包括ER功能的改变，并且FoxO信号通路与雌激素信号通路之间的串扰能降低ERα阳性乳腺癌细胞的恶性行为（侵袭性、迁移性和激素非依耐性生长），增加内分泌治疗的敏感性[43]。P53蛋白由TP53基因编码，是一种应激诱导的转录因子，P53异常表达与乳腺癌不良预后相关。研究表明P53也可影响抗雌激素治疗的反应，如Fernandez-Cuesta等[44]发现P53突变的细胞比野生型P53细胞更能抵抗4-羟基他莫昔芬（OHT）的细胞毒作用，并且P53功能缺失会增加ER与EGFR/HER2通路之间的交叉反应，从而促进乳腺癌对OHT的抵抗作用。肿瘤耐药性和转移的发生是肿瘤细胞重新编程其代谢，以适应灌注不良、短暂的营养缺失及酸度增加的过程。有研究显示，雌激素信号通路能和几个关键代谢调节酶之间串扰，改变乳腺癌细胞的代谢，使肿瘤细胞能够重新连接其代谢，以适应灌注不良、短暂营养缺乏和酸度增加，从而导致耐药和转移[45]。PI3K-Akt信号通路对细胞生长、存活、蛋白质合成和葡萄糖代谢至关重要。研究认为抑制PI3K-Akt信号通路可导致ER活性增加，促进耐药，此外，PI3K-Akt信号通路还可与雌激素信号通路相互串扰，导致乳腺癌ET耐药的发生[46]。

综上，本研究通过网络药理学筛选益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药的主要活性成分及其靶点，对关键靶点进行GO和KEGG富集分析，获得益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药关键靶点的主要基因功能和参与的信号通路。结果显示益肾清肝方的主要活性成分β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、槲皮素、苦参碱、隐丹参酮及儿茶素等可能通过作用于ESR1、TP53、STAT3、MAPK1、PGR等多个靶点，从而影响FoxO、P53、雌激素、PI3K-Akt等多条信号通路发挥作用。分子对接结果显示益肾清肝方主要活性成分与关键靶点对接活性良好，可为后续进一步深入探索益肾清肝方逆转乳腺癌ET耐药的作用机制奠定基础。本研究的不足在于药物活性成分均来源于数据库，且数据库的更新存在延迟，存在药物成分录入不全的情况。此外，本研究仅通过网络预测，未考虑不同产地、剂量、炮制方法对药物活性成分的影响，亦未考虑方中药物在煎煮后成分变化的影响，因此研究结果尚需进一步实验验证。