斑马鱼肿瘤模型研究进展

李 璘，邱蓉丽，魏凯峰，孙东东,3

(南京中医药大学 1.中医学院、2.药学院，3.江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心，江苏 南京 210023)

斑马鱼作为一种体外受精的模式动物，广泛应用于人类多种疾病的研究。由于斑马鱼肿瘤模型与人类肿瘤的高度保守性，许多人类肿瘤相关通路在斑马鱼肿瘤中存在同源物。早在2005年斑马鱼就用于肿瘤的研究[1]，近来转基因斑马鱼和肿瘤移植斑马鱼的出现，使其成为具有发展潜力的一种肿瘤动物模型。

1 斑马鱼在肿瘤研究中的优势

斑马鱼属于非哺乳类脊椎动物，比无脊椎动物线虫和果蝇更加与人类相近，用于体内肿瘤增殖、分裂、转移及抗肿瘤药物的快速筛选研究。斑马鱼先天免疫系统和获得性免疫系统与人和小鼠高度保守，造血系统与人类相似且和人类的血细胞相对应，适用于人类血液肿瘤的研究[2]。斑马鱼受精24 h后主要器官发育完成，受精7～14 d相当于生命的早期阶段，先天免疫系统受精后开始发育，约2～3周获得性免疫系统发育成熟，这个时间窗可以植入人或鼠的肿瘤细胞而不被斑马鱼的免疫系统排斥。斑马鱼产生天然色素前处于透明状态，可以观察肿瘤细胞的生长状态和肿瘤大小[3]。斑马鱼每两周产卵约600～700枚，产生遗传一致的后代，细胞培养板即可饲养。斑马鱼移植的肿瘤与小鼠肿瘤模型具有相似的药物敏感性，肿瘤细胞移植于成体鱼，短时间内可获得大量肿瘤移植模型[4]。转基因斑马鱼和荧光标记细胞的出现，扩大了斑马鱼在肿瘤研究方面的应用。转基因斑马鱼(Casper)终身保持透明，用于肿瘤体内生长、转移、肿瘤血管生成、肿瘤与微环境的相互作用、肿瘤募集免疫细胞能力等多方面的研究。

2 斑马鱼肿瘤模型

2.1 诱发性斑马鱼肿瘤模型诱发性斑马鱼肿瘤模型包括自然状态下发生和致癌剂诱发的肿瘤模型。自然状态下因斑马鱼体温比较低(28.5 ℃)，自发性肿瘤细胞容易发生凋亡，肿瘤的自然发生率比较低，一般发生在1～2年的斑马鱼[3]。自然诱发的肿瘤主要与鱼类病毒、寄生虫及水污染物有关[5]。假毛细线虫(Pseudocapillariatomentosa)感染斑马鱼产生肠道多病灶异常增生物，在感染附近组织形成肿瘤[6]。斑马鱼自发性肠肿瘤包括肠腺癌、小细胞肠癌，它们在肠道中随机分布，常侵袭黏膜皮下组织[7]。斑马鱼的大脑在组织学上与哺乳类动物明显不同，大量前脑、间脑和延脑的嗜碱性胚胎细胞紧紧围绕着脑室系统，脑室周围的细胞容易发生胚胎性神经瘤，这与儿科神经瘤相似。犬、猫等哺乳动物和成人脑部发生神经胶质瘤，但斑马鱼常发生分化度较低的成神经细胞瘤。如果抑癌基因，如tp53、mlh1、msh2、msh6等发生变异，斑马鱼容易发生周围神经鞘瘤[6]。

与人类相似，许多致癌剂可以诱发斑马鱼发生肿瘤，且两者具有组织学相似性。肝脏是斑马鱼最容易发生肿瘤的脏器，因为鱼类的肝脏一生中不停生长，NDMA和DBP可以诱发肝肿瘤。用DEN饲养斑马鱼8周后，肝脏及胰腺发生肿瘤。DMBA和MNNG除可诱发消化系统的肿瘤外，还可诱发免疫系统和神经系统的肿瘤[8]。用DMBA饲养感染假毛细线虫的斑马鱼，肿瘤发病率比没有感染的斑马鱼提高50%[8]。DABA导致斑马鱼发生混合性肿瘤(平滑肌和腺上皮恶性恶性肿瘤)，检测斑马的嵌合眼判断EMS或ENU诱发囊胚期斑马鱼肿瘤发生情况[9]。致癌剂还可以诱发斑马鱼多处血管瘤，眼球脉络膜和鳃处血管容易发生血管瘤，与这些部位丰富的小血管密度大有关[6]。

斑马鱼的诱发性肿瘤与人和哺乳类动物具有很高的相似性，但它们解剖结构上的差异导致其肿瘤类型存在一些不同的特点。斑马鱼的卵巢肿瘤大部分是上皮组织癌，腺癌很少，也极少发生脂肪肉瘤和脂肪瘤。血源性肿瘤除淋巴瘤外，斑马鱼很少患有其它血液肿瘤，气囊罕见发生肿瘤[6]。斑马鱼肿瘤很少发生哺乳类动物类似的自发性淋巴转移和骨髓转移[10]。

化学致癌剂诱导的斑马鱼肿瘤模型操作非常方便，但因其发生率低、肿瘤发生的脏器不确定，具有一定的局限性。但这类肿瘤组织细胞的杂合性与人类肿瘤发生的过程高度相似，常用于因基因变异而诱发肿瘤的病因学研究。

2.2 转基因斑马鱼肿瘤模型现代生物及转基因技术可以改变斑马鱼的遗传背景，将肿瘤诱导基因导入斑马鱼生殖细胞可以形成转基因肿瘤模型。用rag2启动斑马鱼淋巴细胞基因c-myc表达，产生T细胞急性淋巴细胞白血病模型，并从胸腺扩散至骨和内脏组织，hlk，srk和otg基因变异也产生T细胞急性淋巴细胞白血病模型[11]。有学者用电转基因方法，在BRAF/p53-/-/mitfa背景下，Cas9敲除抑癌基因Rb1造成高侵袭性黑色素瘤细胞，7周内100%产生具有免疫相容的黑色素瘤斑马鱼模型[12]。建立这种转基因模型需要大量时间，肿瘤发生位置随机性大，大部分转基因斑马鱼不能成活至性成熟期形成可遗传性的肿瘤模型。

组织特异性启动子可以特异地控制组织的基因表达，诱发特定组织的斑马鱼肿瘤模型。黑色素细胞特异性启动子mitfa促进BRAF高表达，丝氨酸/苏氨酸激酶BRAF活性增加，激活MAPK通路产生黑色素瘤。在p53-/-突变背景下，BRAF激活组氨酸甲基转移酶SETDB1促进黑色素瘤增长，形成黑色素瘤斑马鱼模型。阻断SPRED1后，同时抑制pten和p53后促进斑马鱼粘膜黑色素瘤的生成。BRAF/p53-/-/mitfa斑马鱼仅5%发生黑色素瘤，SETDB1阻断15周后20%形成黑色素瘤[13]。改变许多组织特异性启动子造成斑马鱼肿瘤模型，启动子fabp10促进KRAS或激活肝β-catenin，6个月后诱发斑马鱼产生肝癌，ptf1启动子促进KRAS产生胰腺癌，KRAS或Mylz2基因的表达产生横纹肌肉瘤斑马鱼模型[14-15]。nf1基因的缺失促进转基因斑马鱼MYCN诱导的神经母细胞瘤的侵袭作用，dbh和sox可诱发脑部肿瘤[16-17]。特异性启动子诱发的斑马鱼肿瘤组织特异性强，但存在基因的脱靶现象，有时启动子的组织特异性不强，导致肿瘤发生率不高。

与诱发性斑马鱼肿瘤模型比较，转基因斑马鱼肿瘤模型可控性和发生率均增高，但其操作的复杂性也增加，需要大量的经费和时间。

2.3 植入性斑马鱼肿瘤模型植入性斑马鱼肿瘤模型是将标记的肿瘤细胞植入斑马鱼胚胎或成体鱼不同位置，用于研究肿瘤增殖、转移及抗肿瘤药物。斑马鱼受精后48 h内是植入肿瘤细胞的最佳时期[18]，植入的位置包括卵黄囊、卵周间隙或居维叶氏管，也可以注入成体斑马鱼的腹腔内。肿瘤细胞植入斑马鱼的位置不同，肿瘤细胞的生长方式不同，研究目的也不相同。卵黄囊是有清晰界限无细胞的组织结构，由胆固醇、甘油三酯和磷脂胆碱等脂类物质组成，植入卵黄囊标记的肿瘤细胞非常容易观察，用于研究肿瘤细胞的增殖、分裂和运动功能[19-20]。卵黄周隙没有血管及淋巴管等结构，在发育过程中靠近胸腹部的血管，肿瘤细胞植入卵黄周隙，利于研究在肿瘤细胞刺激下血管发生、血管转移和肿瘤细胞增殖[21]。这种模型观察窗口较短，只有5～6 d(植入后)，并且对幼体产生损伤。也可在2～3 dpf直接将肿瘤细胞(荧光标记)注入居维氏管而导入血循环[22]。循环中的肿瘤细胞在尾部造血组织附近生成肿瘤，适用于肿瘤细胞的血管侵袭转移和EMT的研究。

斑马鱼胚胎免疫系统没有发育成熟，利于外源肿瘤细胞的生长增殖，但因其体积小，仅能植入少量肿瘤细胞。成年斑马鱼可以植入大量肿瘤细胞，每尾鱼可种植5×104个肿瘤细胞，甚至可达2×106个细胞。但成年斑马鱼对外源性肿瘤细胞具有免疫排斥反应而不能生长增殖，因此，成年斑马鱼肿瘤模型需要用免疫抑制剂或γ-射线抑制机体的免疫系统。大剂量地塞米松抑制斑马鱼免疫反应，用高分辨共聚集显微镜可以观察绿色荧光蛋白标记的斑马鱼两周内肿瘤侵袭和转移的情况[21]。γ-射线照射斑马鱼后免疫系统的恢复需要30 d，肿瘤细胞可以生长增殖20 d[23]。也有学者先将肿瘤细胞用射线照射后植入斑马鱼幼鱼，3个月后再植入没有照射的同种肿瘤细胞，这些肿瘤细胞不被免疫系统抑制并表现为肿瘤转移的特点[24]。

用免疫抑制剂或γ-射线照射抑制斑马鱼免疫系统，增加了一个可变因素，还存在抑制剂与筛选药物间可能的相互作用。为了避免高剂量地寒米松或低致死量γ射线所致的不利因素，可用免疫缺陷型斑马鱼建立植入性肿瘤模型。改变斑马鱼rag2基因，降低T、BK细胞数而抑制斑马鱼的免疫系统，可在不同位置植入肿瘤细胞[25]。采用prkdc-/-和il-2rga-/-基因突变造成免疫缺陷斑马鱼(T、B、NK细胞缺陷)，这种斑马鱼可以37 ℃水温中饲养，移植肿瘤细胞株或患者肿瘤细胞可以生长28 d，有效地避免了肿瘤细胞与斑马鱼生长的温度差异问题[26]。

植入性斑马鱼肿瘤模型与诱发性及转基因斑马鱼肿瘤模型比较具有更高的可控性，研究者可以将肿瘤细胞植入斑马鱼的不同位置实现自己的研究目的。但斑马鱼胚胎或成体斑马鱼的免疫系统处于不成熟或抑制状态，对研究肿瘤细胞与免疫细胞间的相互作用有一定的影响。

3 结语

斑马鱼肿瘤模型制作方法简便、实验周期短，有较好的重现性，与人类基因高度相似，且具有体内成像、遗传易处理性和药物效应测试的顺从性等特点，给学者提供了研究肿瘤机制的独特优势。斑马鱼肿瘤模型已经取得了很大的进展，但斑马鱼肿瘤模型也有其局限性。斑马鱼个体小，解剖及组织定位有一定的难度，原位肿瘤植入难度较大。斑马鱼可以产生大量遗传一致的后代，但胚胎和幼体死亡率较高，后代的纯合子雄性多于雌性。斑马鱼可以用来研究胃癌、肺癌、乳腺癌及前列腺癌，但因其没有相应的组织结构而不能进行原位肿瘤的研究[27-28]。斑马鱼移植瘤生长时间短、种植细胞少，很难进行获得性肿瘤抗药性研究[29]，也缺乏相应有效的斑马鱼蛋白抗体。斑马鱼正常体温约28 ℃，哺乳类动物的肿瘤细胞高于这个体温，并且有些肿瘤细胞的关键基因对温度非常敏感。虽然斑马鱼肿瘤模型有以上不足，但不可否认，斑马鱼作为新兴的独具特点的实验动物，其肿瘤模型给人类抗肿瘤药物高通量筛选，预测抗肿瘤药物的抗肿瘤范围以及临床肿瘤个体化治疗方案提供非常有用的价值，也为肿瘤的研究提供了新的途径和模型系统。