基于分子对接分析复方一枝黄花喷雾剂抗HIV-1蛋白酶和组织蛋白酶 L的研究

朱海燕 庄田畋 杨 欣 危 英* 李 星 陈 梅 夏 文 周 英

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州百灵制药股份有限责任公司，贵阳 安顺 550001

复方一枝黄花喷雾剂由一枝黄花、贯众、山银花、连翘、荆芥、艾纳香、薄荷制成的喷雾剂[1]。由贵州百灵企业集团制药股份有限公司生产，主要功效为清热解毒，宣散风热，清利咽喉。用于上呼吸道感染，急、慢性咽炎，口舌生疮，牙龈肿痛，口臭[2]。已有文献[3-5]报道一枝黄花、山银花、贯众、连翘等中药具有抗病毒的作用。但是复方一枝黄花喷雾剂对HIV-1蛋白酶和Cathepsin L蛋白酶活性的影响尚未研究。目前，在药物研发的过程中，很多中药及复方的活性化合物的筛选依靠分子对接完成，优化的小分子与蛋白通过计算机模拟打分，快速有效地发现小分子活性成分[6]。分子对接技术已经应用到很多领域，得到的结果较为理想[7]。因此本研究采用药物分子设计模拟 SYBYL 2.1.1 软件的Surflex-Dock和模块完成复方一枝黄花喷雾剂药效物质与HIV-1蛋白酶和Cathepsin L蛋白酶的分子对接分析，为发现及开发抗病毒药物提供理论依据。

1 数据库及软件

中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/.tcmspsearch)；SwissADME(http://www.swissadme.ch/)；蛋白质晶体结构数据库RCSB (http://www. rcsb. org/pdb )；SYBYL 2.1.1(Tripos)处理器为Inter(R) Core(TM) i5-7500 CPU@3.4GHz，64位操作系统，软件已授权。

2 实验方法

2.1 复方一枝黄花喷雾剂活性成分筛选 通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)相关指标[8]：口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)、分子量(Molecular Weight ,MW)、类药性(Drug Likeness,DL)筛选丹参化学成分，OB通过OBioavail模型对进行预测，DL通过Tanimoto 系数通过药物之间的Tanimoto进行计算。一般认为OB大的化学成分具有好的口服生物利用度，DL≥0.18 的分子具有较好的类药性。基于中药系统TCMSP在Herb name中进行查找复方一枝黄花喷雾剂的化学成分。相关参数设置为：OB≥40%，DL≥0.18，MW≤500，保存为mol2 格式。

2.2 复方一枝黄花喷雾剂小分子能量优化 复方一枝黄花喷雾剂基于Tripos力场对小分子配体进行结构优化，获得合理构象。点击File > Import File，Files of type选molecule，在Directory选择小分子所在的文件位置，然后在Selection 列表中点击需导入的分子；设置Force Field为Tripos，Charges为Gasteiger-Huckel电荷；设置最大重复次数(Max. Iterations)为10000；设置Gradient为0.005；设置Color Option为Force。

2.3 分子对接 采用药物分子设计模拟 SYBYL 2.1.1 软件的Surflex-Dock模块完成分子对接研究。从蛋白质晶体结构数据库RCSB (http://www.rcsb.org/pdb ) 获取HIV-1蛋白酶(PDB ID:1QBS)和Cathepsin L蛋白酶(PDB ID:3OF9)。建立存放需要对接的蛋白和小分子的文件夹，Surflex-dock使用原型分子(即protomol)来表示蛋白结合口袋，本研究基于原配体小分子确定活性口袋。对接模式选择标准对接。对接完成后，一个分子会产生很多种构象。软件默认是按Total_Score打分值进行排序[9]。

2.4 化合物与靶标蛋白相互作用分析 Ligplot作为经典的配体与蛋白二维相互作用作图软件，应用较广泛，氢键和疏水作用基于HBPLUS程序计算，以2D的形式展示结构，方便观察。本研究基于Ligplot1.4.5版本，小分子与蛋白Merg为PDB格式保存，导入Ligplot软件中，可以研究多个配体在同一个受体中的结合、单个配体与不同受体的结合或者不同配体在不同受体中的结合，并自动计算形成的氢键、疏水作用和结构比对[10]。

2.5 关键化学成分的ADME/T性质 基于SwissADME和TCMSP进行初期药物开发毒性筛选。相关参数包括有溶解度，血脑屏障穿透性，氢键受体数(H-bond acceptors，HBA)，可旋转键数 (rotatable bonds，RBN)，血屏障穿透性 (blood-brain barrier，BBB)，氢键供体数 (H-bonddonors，HBD)，Caco-2 细胞通透性 (Caco-2 cell permeabilic)等。

3 实验结果

3.1 复方一枝黄花喷雾剂活性成分 基于TCMSP和文献筛选出复方一枝黄花喷雾剂活性成分，其中一枝黄花11个化学成分，贯众7个化学成分，薄荷10个化学成分，荆芥11个，连翘23个化学成分，山银花6个化学成分，艾纳香6个化学成分。共收集复方一枝黄花喷雾剂活性成分74个。

3.2 分子对接分析

3.2.1 复方一枝黄花喷雾剂化合物与HIV-1蛋白酶分子对接分析 目前FDA上市的抗HIV-1蛋白酶抑制剂已达10个，包括：Saquinavir(沙奎那韦，SQV)、Ritonavir(利托那韦，RTV)、Indinavir(茚地那韦，IDV)等。本研究将选择SQV和RTV为阳性对照药。SQV和RTV与HIV-1蛋白酶对接得分为7.1和11.8(T_Score)。根据阳性药对接结果，本研究选择T_Score>7为阈值，复方一枝黄花喷雾剂74个活性成分，其中26个活性成分与HIV-1蛋白酶结合得分大于7(表1)。其中化学成分Diosmetin和Harmonyl与HIV-1蛋白酶结合的最好。

表1 复方一枝黄花喷雾剂化合物与HIV-1蛋白酶分子对接分析表

3.2.2 复方一枝黄花喷雾剂化合物与组织蛋白酶L分子对接分析 SID 26681509 是人组织蛋白酶 L (human cathepsin L) 抑制剂。研究将SID 26681509作为阳性对照，分子对接的结果显示，SID 26681509与Cathepsin L 结合得分为10.4(T_Score)，与SID 26681509对比，尚未发现复方一枝黄花喷雾剂的化学成分与Cathepsin L 结合得分超过10.4，但是复方一枝黄花喷雾剂与Cathepsin L结合T_Score≥7的化学成分有5个，后面也会重点研究这些化合物的体内活性。其中化学成分2-Methoxybenzyl-2,3,6-trimethoxybenzoate和Supraene与组织蛋白酶 L结合的最好。

表2 复方一枝黄花喷雾剂化合物与组织蛋白酶 L分子对接分析表

3.3 相互作用分析 化学成分Diosmetin和Harmonyl与HIV-1蛋白酶结合的最好，化学成分2-Methoxybenzyl-2,3,6-trimethoxybenzoate和Supraene与组织蛋白酶 L结合的最好，通过Ligplot1.4.5软件进行相互作用分析，结果以氢键、疏水作用输出，筛选关键的氨基酸位点。结果由图1显示，Diosmetin与HIV-1蛋白酶相互作用形成四个氢键(Gly27、Gly48、Gly49、Arg8)，Harmonyl与HIV-1蛋白酶相互作用形成两个氢键(Arg8、Asp30)；结果由图2显示，2-Methoxybenzyl-2,3,6-trimethoxybenzoate和Supraene与组织蛋白酶L相互作用有很大的相似性，与Asp72、Met71、Leu70等氨基酸残基类型及相对位置相同。

图1 Diosmetin (A)和Harmonyl(B)与HIV-1蛋白酶相互作用的关键氨基酸图

图2 2-Methoxybenzyl-2,3,6-trimethoxybenzoate(A)和Supraene(B)与组织蛋白酶 L相互作用的关键氨基酸图

3.4 复方一枝黄花喷雾剂关键活性成分理化性质分析 通过分子对接分子发现复方一枝黄花喷雾剂16个化学成分与HIV-1和Cathepsin L分子对接得分均大于5，虽然尚未超过阳性药，但是可能与HIV-1和Cathepsin L具有潜在的结合，因此对复方一枝黄花16个化学成分进行ADMET性质分析，为体内实验做准备。BBB<-0.3 的化合物被认为是非穿透性(BBB-)，从-0.3到0.3的中等穿透性(BBB±)，并且 >0.3表示强穿透力(BBB+)。Caco-2细胞模型作为一个标准的小肠渗透筛选模型已经被越来越广泛的接受。根据Lipinski规则，小分子应该具备H-bond acceptors<5，H-bond donors<10，Rotatable bonds<10。如果过多参数不符合，会影响药物的溶解性及肠吸收能力，16个化学成分，具有较好的口服吸收利用度，基本遵循Lipinski规则(表3)。

表3 复方一枝黄花喷雾剂关键活性成分

4 讨论

人类的健康与生存受到病毒的严重威胁，其中病毒蛋白酶可将前体蛋白剪切修饰得到成熟蛋白[11]。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染可导致获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，导致全身免疫功能衰竭并产生并发症[12]。抗HIV-1药物目前有整合酶抑制剂(INIs)、逆转录酶抑制剂(RTIs)、蛋白酶抑制剂(PIs)等，抗HIV-1蛋白酶抑制剂已经有10个[13]。组织蛋白酶L分布广泛，如细胞质、细胞核和细胞外基质中，参与蛋白质降解及维持细胞内蛋白平衡，与多种病理生理过程相关。已经有相关研究[14]表明抑制组织蛋白酶L过度激活已成为治疗相关炎症性疾病的重要靶标。目前，已经筛选出多种类型的抗 HIV-1天然化合物，但是作用于HIV-1整合酶和蛋白酶的比较少。进一步研究开发新的组织蛋白酶L和HIV-1抑制剂药物，具有广阔发展前景。 复方一枝黄花喷雾剂由一枝黄花、贯众、山银花、连翘、荆芥、艾纳香、薄荷制成的喷雾剂。收集复方一枝黄花喷雾剂化学成分，有望从中筛选出抗HIV-1蛋白酶和Cathepsin L的抑制剂，通过分子对接发现复方一枝黄花喷雾剂有潜在的抗HIV-1和Cathepsin L的化学成分，在今后的研究中，我们将选择筛选出的有效的抗HIV-1和Cathepsin L化学成分进行体内研究，进一步验证其筛选结果。