藏药柳兰中黄酮类成分研究

张金魁 林鹏程 王志波 刘晓翠,3 王 敏,3 马 敏,3

1.青海民族大学药学院，青海 西宁 810007；2.天津大学管理与经济学部，天津 300072；3.青海省青藏高原植物化学重点实验室，青海 西宁 810007

柳兰(EpilobiumangustifoliumL.)是柳叶菜科柳兰属植物，为常用藏药材，藏文名“恰班曲孜”，分布于青海、西藏、云南、四川等地区[1]。全草入药，味酸，性凉，利尿消肿和清热利胆功效较好，主治“赤巴”热、胆囊炎、热性腹泻、排尿困难症及肠道寄生虫疾病[2-5]。在俄罗斯，柳兰叶常被用作茶叶的替代品，称为“卡普茶”或“伊万茶”，用于治疗胃炎、胃溃疡和睡眠障碍[6-7]，我国也有柳兰制茶的报道。柳兰主要含酚酸、黄酮和鞣质类成分，现代药理学研究[8-9]发现，柳兰具有抗菌、抗炎、免疫调节等多种药理活性。课题组前期研究[10]表明，柳兰挥发油提取物对多种常见致病菌具有显著的抑制活性，其乙醇提取物对细胞周期调控蛋白CDC25A/CDC25B磷酸酶表现出明显的抑制活性[11]。为明确柳兰广泛的药理活性的物质基础，进一步开发利用该药材资源，课题组对柳兰中的化学成分进行了系统研究，从其95%乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位中分离得到了11个黄酮类化学成分。其中，化合物1为首次从柳兰中分离得到，化合物7、9、10为首次从柳叶菜科植物中分离得到。

1 仪器与材料

硅胶(200-300目)(青岛海洋化工)，薄层色谱板(青岛海洋化工)，Sephadex LH-20(上海市纪宁实业有限公司)，MCI树脂(日本三菱化学公司)，石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇均为分析纯(天津市红岩化学试剂厂)，色谱甲醇(山东禹王和天下新材料有限公司)，乙醇为工业级试剂，三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司)，制备型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，Agilent ZORBAX SB-C1821.2 mm×250 mm 7 μm 色谱柱(美国Agilent公司)，Bruker Avance 500 MHz核磁共振波溥仪(德国Bruker公司)。

药材柳兰于2018年7月(花期)采自青海互助北山林场，由林鹏程教授鉴定为柳叶菜科柳兰属植物柳兰E.angustifoliumL.，植物样本洗净阴干，标本保存于青海省青藏高原植物化学重点实验室标本室，标本号为No．MD02312。

2 提取与分离

柳兰全草粗粉(5.7 kg)经50 L 95%乙醇浸泡 7 d，滤过，残渣用40 L 95%及70%乙醇分别热回流提取1次，每次90 min，浓缩所有提取液得总浸膏1.208 kg。将用热水分散提取物后，依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，得到4个萃取部位A-D。对乙酸乙酯部位(B)采用正相硅胶柱色谱经氯仿-甲醇体系梯度洗脱(40∶1-0∶1，V/V)，合并薄层色谱行为相似的组分合并和得到6个组分(Fr. A-F)。Fr.C部位采用MCI树脂柱经甲醇-水10%～60%体系梯度洗脱得6个部位Fr.C1～C6，并将以上部位进一步通过反复柱色谱以及制备色谱分离得到化合物1～5。正丁醇部位干燥浸膏与乙酸乙酯部位大极性部分合并，采用MCI为填料，经甲醇-水梯度洗脱(5%～60%)，分离得到5个洗脱部位Fr.D1～D5，并将以上部位进一步通过反复柱色谱以及制备色谱分离得到化合物6～11。其中，化合物1为首次从柳兰乙酸乙酯部位中分离得到，化合物7、9、10为首次从柳叶菜科植物中分离得到。

3 结构鉴定

经与文献匹配，所分离得到的11个化合物的鉴定数据与相关已报道化合物基本一致，以下为各化合物的核磁数据。

化合物1：槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(quercetin 3-O-β-D-glucuronide)[12]，淡黄色粉末，分子式为C21H18O13，分子量为478，盐酸-镁粉反应、Molish反应都为阳性。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ：7.61 (1H,m,H-2′,6′),6.82 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5′ ),6.33 (1H,d,J=1.9 Hz,H-8),6.15 (1H,d,J=1.9 Hz,H-6),5.30 (1H,d,J=7.2 Hz,H-1″),3.29～3.67 (4H,m,H-2″,3″,4″,5″);13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ：179.1 (C-4),172.2 (C-6″),165.9 (C-7),162.9 (C-5),158.9 (C-9),158.3 (C-2),149.8 (C-4′),145.9 (C-3′),135.3 (C-3),123.5 (C-6′),122.8 (C-1′),117.2 (C-5′),116.0 (C-2′),105.5 (C-10),104.2 (C-1″),99.9 (C-6),94.7 (C-8),77.5 (C-3″),77.0 (C-5″),75.3 (C-2″),72.8 (C-4″)。

化合物2：金丝桃苷(槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷)(hyperoside)[13]，淡黄色粉末，分子式为C21H20O12，分子量为464，FeCl3反应、Molish反应、盐酸-镁粉反应都为阳性。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ：7.67 (1H,dd,J=8.4,2.4 Hz,H-6′),7.52 (1H,d,J=2.4 Hz,H-2′),6.81 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.40 (1H,d,J=2.4 Hz,H-8 ),6.20 ( 1H,d,J=2.4 Hz,H-6 ),5.38 ( 1H,d,J=9.5 Hz,H-1″ ),3.43～3.66 (3H,m,H-2″,4″,6a″);13C-NMR (100MHz,DMSO-d6)δ：177.5 (C-4),164.1 (C-7),161.2 (C-5),156.3 (C-9),156.2 (C-2),148.5 (C-4′),144.8 (C-3′),133.5 (C-3),122.0 (C-6′),121.1 (C-1′),115.9 (C-5′),115.2 (C-2′),103.9 (C-10),101.8 (C-1″),98.7 (C-6),93.5 (C-8),75.8 (C-5″),73.2 (C-3″),71.2 (C-2″),67.9 (C-4″),60.1 (C-6″)。

化合物3：槲皮苷(槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷)(quercitrin)[14]，淡黄色粉末，分子式为C21H20O11，分子量为448，盐酸-镁粉反应和Molish反应都为阳性。1H-NMR (400MHz,DMSO-d6)δ：12.65 (1H,s,5-OH),10.86 (1H,s,7-OH),9.70 (1H,s,4′-OH),9.33 (1H,s,3′-OH),7.30 (1H,brs,H-2′),7.25 (1H,d,J=8.4 Hz,H-6),6.86 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.39 (1H,d,J=2.4 Hz,H-8),6.20 (1H,d,J=2.4 Hz,H-6),5.25 (1H,s,H-1′);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)：δ177.8 (C-4),164.2 (C-7),161.3 (C-5),157.4 (C-9),156.5 (C-2),148.5 (C-4′),145.2 (C-3′),134.2(C-3),121.2 (C-1′),120.4 (C-6′),115.7 (C-2′),115.5 (C-5′),104.1 (C-10),101.8 (C-1″),98.7 (C-6),93.7 (C-8),71.2 (C-4″),70.6 (C-2″),70.3 (C-3″),70.1 (C-5″),17.6 (C-6″)。

化合物4：木犀草素(luteolin)[15]，淡黄色粉末，分子式为C15H10O6，分子量为286，FeCl3反应与Molish反应呈阴性，盐酸-镁粉反应为阳性。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ： 12.98 (1H,s,5-OH),10.83 (1H,s,7-OH),9.92 (1H,s,4′-OH),9.40 (1H,s,3′-OH),7.41 (2H,m,H-2′,6′),6.89 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.68 (1H,s,H-3),6.45 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.19 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ：181.6 (C-4),164.1 (C-2),163.9 (C-7),161.5 (C-9),157.3 (C-5),149.7 (C-4′),145.7 (C-3′),121.5 (C-1′),119.0 (C-6′),116.0 (C-5′),113.4 (C-2′),103.7 (C-10),102.9(C-3),98.8 (C-6),93.8 (C-8)。

化合物5：槲皮素(quercetin)[16]，黄色粉末状。API-ESI-LC-MS m/z：303.1 [M+H]+；分子式为C15H10O7。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ：12.41 (1H,s,OH-5),7.61 (1H,d,J=2.2 Hz,H-2′),7.52 (1H,dd,J=8.5,2.2 Hz,H-6′),6.88 (1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.42 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.18 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6)；13C-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ：147.4 (C-2),136.2 (C-3),176.3 (C-4),161.2(C-5),98.8 (C-6),164.4 (C-7),94.1 (C-8),156.7 (C-9),103.5 (C-10),122.5 (C-1′),115.5 (C-2′),145.5 (C-3′),148.2 (C-4′),116.2 (C-5′),120.8 (C-6′)。

化合物6：阿福豆苷(山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷)(afzelin)[17]，黄绿色粉末；分子式为C21H20O10，分子量为432，盐酸-镁粉反应、Molish反应、FeCl3反应都为阳性。1H-NMR (500MHz,CD3OD)δ：7.77 (2H,d,J=8.0 Hz,H-2′,6′),6.93 (2H,d,J=8.0 Hz,H-3′,5′),6.37 (1H,s,H-8),6.20 (1H,s,H-6),5.39 (1H,s,H-1″),4.22 (1H,s,H-2″),0.92 (3H,s,H-6″);13C-NMR (125MHz,DMSO-d6)δ：179.6 (C-4),166.4 (C-7),163.2 (C-5),161.6 (C-4′),159.2 (C-2),158.6 (C-9),136.2 (C-3),131.9 (C-2′,6′),122.6 (C-1′),116.5 (C-3′,5′),105.8 (C-10),103.5 (C-1″),100.0 (C-6),94.9 (C-8),73.2 (C-4″),72.1 (C-3″),72.0 (C-2″),71.9 (C-5″),17.7 (C-6″)。

化合物7：山奈酚-3-O-α-L -阿拉伯呋喃糖苷(kaempferol-3-α-L-arabinofuranoside)[18]，淡黄色粉末，分子式为C20H18O10,分子量为418，盐酸-镁粉反应、FeCl3反应与Molish反应都为阳性。1H-NMR (500MHz,CD3OD)δ：7.97 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2′,6′),6.94 (2H,d,J=8.5 Hz,H-3′,5′),6.38 (1H,s,H-8),6.20 (1H,s,H-6),5.49 (1H,s,H-1″);13C-NMR (125MHz,CD3OD)δ：179.7 (C-4),161.7 (C-7),161.6 (C-5),161.6 (C-4′),159.1 (C-2),158.7 (C-9),134.8 (C-3),131.9 (C-2′,6′),122.8 (C-1′),116.5 (C-3′,5′),109.6 (C-1″),105.1 (C-10),100.5 (C-6),95.2 (C-8),88.0 (C-4″),83.3 (C-2″),78.6 (C-3″),62.5 (C-5″)。

化合物8：槲皮素-3-O-α-L -阿拉伯呋喃糖苷(quercetin -3-α-L-arabinofuranoside)[19]，淡黄色粉末。API-ESI-LC-MS m/z：457.1 [M+Na]+。分子式为C20H18O11，分子量为434，盐酸-镁粉反应、FeCl3反应与Molish反应都为阳性。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ：12.64 (s,1H,5-OH),10.87 (s,1H,7-OH),9.72 (s,1H,4′-OH),9.27 (s,1H,3′-OH),7.55 (dd,J=8.4,2.2 Hz,1H,6′-H),7.48 (d,J=2.2 Hz,1H,2′-H),6.85 (d,J=8.4 Hz,1H,5′-H),6.40 (d,J=1.8 Hz,1H,8-H),6.20 (d,J=1.8 Hz,1H,6-H),5.58 (d,J=1.0 Hz,1H,1″-H),3.72 (m,1H,3″-H),3.56 (m,1H,4″-H);13C-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ：177.7 (C-4),164.3 (C-7),161.2 (C-5),156.9 (C-9),156.3 (C-2),148.5 (C-4′),133.4 (C-3),121.7 (C- 6′),115.5 (C-2′),120.9 (C-1′),145.1 (C-3′),115.5 (C-5′),103.9 (C-10),107.8 (C-1″),98.7 (C-6),93.5 (C-8),76.9 (C-3″),85.8 (C-4″),82.1 (C-2″),60.6 (C-5″)。

化合物9：桑色素-3-O-α-L-鼠李糖苷(morin-3-O-α-L-rhamnoside)[20]，黄色粉末，分子式为C21H20O11，分子量为448，盐酸-镁粉反应、FeCl3反应和Molish反应都为阳性。1H-NMR (500MHz,DMSO-d6)δ：12.64 (1H,s,5-OH),10.86 (1H,s,7-OH),9.69 (1H,s,4′-OH),9.32 (1H,s,2′-OH),7.29 (1H,d,J=2.5 Hz,H-3′),7.25 (1H,dd,J=8.5,2.5 Hz,H-5′),6.85 (1H,d,J=8.5 Hz,H-6′),6.38 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.19 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6),5.24 (1H,d,J=1.5 Hz,H-1″),0.81 (3H,d,J=6.0 Hz,H-6″);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ：177.7 (C-4),164.2 (C-7),161.3 (C-5),157.3 (C-2),156.4 (C-9),148.4 (C-4′),145.2 (C-2′),134.2 (C-3),121.7 (C-6′),120.7 (C-1′),115.6 (C-3′),115.4 (C-5′),104.1 (C-10),101.8 (C-1″),98.7 (C-6),93.6 (C-8),71.2 (C-4″),70.6 (C-3″),70.3 (C-5″),70.1 (C-2″),17.5 (C-6″)。

化合物10：槲皮素-3-O-α-D-阿拉伯吡喃糖苷(quercetin-3-O-α-D-arabinopyranoside)[21]，黄色无定型粉末，分子式为C20H18O11，分子量为434，盐酸-镁粉反应、FeCl3反应与Molish反应都为阳性。1H-NMR (500MHz,DMSO-d6)δ：12.64 (1H,s,5-OH),7.65 (1H,d,J=8.5 Hz,H-6′),7.51 (1H,d,J=1.5 Hz,H-2′),6.83 (1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.40 (1H,s,H-8),6.20 (1H,s,H-6),5.28 (1H,d,J=10.0 Hz,H-1″);13C-NMR (125MHz,DMSO-d6)δ：177.5 (C-7),164.3 (C-5),161.2 (C-2),156.3 (C-9),148.6 (C-4′),145.0 (C-3′),133.7 (C-3),122.1 (C-6′),120.9 (C-1′),115.7 (C-2′),115.3 (C-5′),103.9 (C-10),101.4 (C-1″),98.7 (C-6),93.5 (C-8),71.6 (C-3″),70.7 (C-2″),66.0 (C-4″),64.2 (C-5″)。

化合物11：芦丁 (rutin)[22]，淡黄色粉末，分子式为C27H30O16，分子量为610，盐酸-镁粉及Molish反应为阳性。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ：12.60 (1H,s,5-OH),10.82 (1H,s,7-OH),9.65 (1H,s,4′-OH),9.16 (1H,s,3′-OH),7.53 (1H,m,H-2′,6′),6.84 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.38 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.19 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6),5.35 (1H,d,J=7.5 Hz,H-1″),4.38 (1H,brs,H-1″′),0.99 (3H,d,J=6.0,H-6″′);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ：177.3 (C-4),164.0 (C-7),161.2 (C-5),156.6 (C-9),156.4 (C-2),148.4 (C-4′),144.7 (C-3′),133.3 (C-3),121.6 (C-6′),121.2 (C-1′),116.2 (C-5′),115.2 (C-2′),104.0 (C-10),101.2 (C-1″),100.7 (C-1″′),98.6 (C-6),93.6 (C-8),76.4 (C-3″),75.9 (C-5″),74.1 (C-2″),71.8 (C-4″′),70.5 (C-2″′),70.4 (C-4″),70.0 (C-3″′),68.2 (C-5″′),67.0 (C-6″),17.7 (C-6″′)。

4 讨论

柳兰在我国野生分布广泛，是一种兼具观赏性和药食两用价值的植物资源。黄酮类化合物作为柳兰中重要的一类活性成分具有广谱的药理活性，对其中黄酮类成分进行系统的研究十分必要。本研究从柳兰中分离得到的11种黄酮类成分中，槲皮素具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等药理作用[23-24]，金丝桃苷具有提高机体的抗氧化能力和抗疲劳作用[25],槲皮苷能够提高免疫水平[26]，阿福豆苷具有较好的肿瘤抑制作用[27]，这些药理研究报道与藏医具有“利尿消肿和清热利胆”功能，主治“赤巴”热、胆囊炎等具有一致性，表明柳兰黄酮类成分是其广谱药理活性的重要物质基础。因此，深入研究柳兰黄酮类成分中的有效成分及生物活性，发掘其更多的药用价值，对保护开发柳兰药材资源具有重要意义。