松材线虫致病机理研究进展

理永霞，王璇，刘振凯，张星耀

(1. 中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所，国家林业和草原局森林保护学重点实验室，北京 100091；2. 南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院，江苏 南京 210037)

松材线虫病(pine wilt disease，PWD)又称松树萎蔫病、松树枯萎病，是我国目前危害最为严重的自然灾害之一。 该病自1982 年在我国首次报道后[1]，在我国热带和亚热带地域迅速蔓延，近年来又逐步入侵暖温带，突破年均温10 ℃线扩张至辽宁等中温带和秦岭等高海拔地域，引起大面积松林枯死，造成了巨大的林业经济与生态损失[2]。 另外，基于松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的起源、极强的环境适应性、寄主植物的广泛分布、媒介昆虫的广泛存在及经济物流等活动的高速发展等因素分析，我国松材线虫病新发生和未发生地区如辽宁、吉林和内蒙古等面临松材线虫入侵扩张的高风险[3]。 鉴于当前松材线虫病危害现状和入侵扩张的严峻形势，亟待提出该病有效防控策略。

松材线虫致病机理是该病有效防控策略产出的理论基础，也是松材线虫病研究的核心内容。 关于松材线虫致病机理存在酶学说、毒素学说和空洞化学说3 种观点。 酶学说认为松材线虫会分泌细胞壁降解酶破坏寄主细胞壁进而引起植物枯萎死亡[4－5]；毒素学说认为松材线虫及其伴生细菌[6]会分泌或诱导寄主产生有毒物质引起寄主发生病变死亡[7－9]；而空洞化学说认为，松材线虫入侵后，诱导寄主体内萜烯类物质含量急剧增加，这些物质具有强烈挥发性和疏水性，渗漏到松树管胞后切断管胞内水分运输，最终导致松树因缺水而死亡[10－12]。 3种学说分别从生理生化以及组织病理学角度揭示了松材线虫致病机理。 近年来，随着高通量测序技术的推广普及，基因组、转录组、蛋白质组以及RNA测序等广泛用于松材线虫致病基因筛选，关于松材线虫致病机理的研究取得了较好研究进展。

松材线虫病是由松材线虫、寄主植物、媒介昆虫、伴生细菌和真菌组成的复杂病害系统，同时又受环境因子及人类经济物流活动等多种因素影响。 其中，松材线虫为主要病原，由媒介昆虫传播接种到寄主松树后，诱导寄主松树枯萎死亡。 除了病原松材线虫与寄主松树之间的互作之外，松材线虫伴生微生物以及松树内栖微生物作为病害系统中的重要组成部分，在病害发生过程中也发挥了重要作用。

基于松材线虫病病害发生过程，结合最新研究相关热点，笔者对最近几年关于松材线虫致病机理以及松材线虫伴生微生物和松树内栖微生物在致病过程中的作用进行回顾总结分析，梳理制约有效防控技术产出的瓶颈问题，以明确下一步研究方向和内容。

1 松材线虫在致病过程中对寄主的作用

松材线虫致病过程是松材线虫致病性与寄主松树抗性博弈的过程。 在这过程中，松材线虫克服了寄主抗性，成功在树体内定殖扩散，最终导致寄主枯萎死亡。 因此，松材线虫致病机理研究的核心内容是研究松材线虫如何克服寄主防御反应，如何导致寄主枯萎死亡等科学问题。 总结最新相关研究进展发现，松材线虫克服了寄主植物细胞壁等物理防御以及活性氧和萜烯类物质等化学防御，同时通过功能因子干扰寄主防御最后导致寄主枯萎死亡。

1.1 松材线虫分泌细胞壁降解酶克服寄主物理屏障

寄主松树细胞壁是松材线虫入侵和取食的主要障碍。 松材线虫入侵时，寄主松树木质素等次生细胞壁相关物质合成酶基因上调表达，诱导寄主细胞壁增厚，限制松材线虫入侵[13－14]。 因此，为了成功入侵，松材线虫分泌细胞壁降解酶破坏植物细胞壁，克服寄主物理屏障[15]。 松材线虫分泌的细胞壁降解酶主要包括纤维素酶(cellulase)、糖基水解酶(glycosyl hydrolase)、果胶裂解酶(pectate lyases)、扩展蛋白(expansin)、α－L－糖苷酶(α－L－glycosidase)等[4]。

纤维素酶具有纤维素和半纤维素酶活性，通过食道腺上皮细胞和口针分泌到寄主体内后，作用于植物细胞壁纤维素－半纤维素复合物，降解寄主细胞壁，因此被认为是松材线虫降解植物细胞壁的关键酶[16－18]。 RNA 干扰(RNAi)沉默松材线虫纤维素酶基因后，松材线虫在寄主体内的迁移速率降低，致病力减弱[19－20]。 纤维素酶不仅能降解植物细胞壁的纤维素，使松材线虫在早期寄生过程中能顺利侵入寄主体内而成功定殖，而且在病害后期松材线虫腐生取食真菌阶段也有重要作用[19]。 因此，纤维素酶在松材线虫致病过程中发挥了重要作用。

糖基水解酶是松材线虫主要细胞壁降解酶之一[21]。 松材线虫拥有多个糖基水解酶基因，可能是通过水平基因转移从真菌中获得的[21－23]。 松材线虫糖基水解酶在松材线虫基因组中具有多个拷贝和串联重复序列，拷贝数与松材线虫致病性有关，串联重复序列的差异可导致蛋白质序列的变化，从而也会影响其致病性。 因此，松材线虫特异性糖基水解酶基因通过拷贝序列和串联重复序列的变化来实现其基因功能，从而在松材线虫寄生过程中发挥不同作用[24]。 糖基水解酶家族30(Bx －GH30)基因在高致病性的松材线虫中大量表达，并且可以引起模式植物本氏烟Nicotiana benthamiana细胞程序化死亡，从而在松材线虫致病过程中发挥着作用[25]。

果胶裂解酶在松材线虫致病过程中也发挥着重要作用。 Kikuchi 等[26]克隆了松材线虫果胶裂解酶基因(Bx－pel1)，该基因具有多聚半乳糖醛酸活性，在松材线虫致病过程中大量表达[27]，在食道腺中特异表达后通过口针分泌到寄主细胞中，有助于松材线虫在树体内取食和迁移。 RNAi 沉默该基因后，松材线虫在树体内繁殖率和迁移率降低，致病性也降低[28]。 果胶裂解酶基因(Bx －pel3)也在食道腺中特异表达，可以通过口针分泌到寄主细胞中，降解植物细胞壁，在松材线虫致病过程中发挥作用[29]。

松材线虫扩张蛋白酶基因在与寄主互作过程中大量上调表达[30]，在侧腹腺细胞中特异表达后，可以通过口针分泌到寄主细胞中，参与松材线虫致病过程[31]。 完整降解植物细胞壁中的木葡聚糖，必须释放葡聚糖主干上的取代基，α－L－糖苷酶可裂解木葡聚糖分支中的L－糖苷残基，在植物细胞壁降解中也发挥了重要作用[32]。

总之，松材线虫入侵时通过分泌大量细胞壁降解酶，降解寄主松树细胞壁，克服寄主物理障碍，为松材线虫在树体内迁移、取食和繁殖奠定基础，从而在松材线虫的致病过程中发挥重要作用。 但松材线虫细胞壁降解酶在致病过程中作用的分子机理还需更直接的证据和深入研究。

1.2 松材线虫通过解毒基因消除寄主化学防御

松材线虫入侵后，寄主会产生大量的活性氧以及萜烯类物质等化学防御物质[33－35]抵抗或抑制松材线虫的入侵。 活性氧可使酶失活、蛋白质氧化、DNA 损伤、脂质过氧化和蛋白质变性等，破坏细胞功能和完整性，对松材线虫具有强烈的毒害作用[36]；萜烯类物质会影响松材线虫繁殖率和致病性[37－39]。 为了能在寄主体内成功定殖，松材线虫必须通过解毒作用，降解或消除寄主的这些化学防御产物，因此，松材线虫致病过程中大量解毒基因上调表达，这些解毒基因主要包括活性氧清除相关基因以及萜烯类物质解毒途径相关基因。

关于活性氧的清除，松材线虫进化出了多层抗氧化策略来保护自身免受寄主活性氧的毒害[40]。在与寄主互作过程中，松材线虫过氧化物酶(peroxidase，PRXs)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPXs)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SODs)等大量表达[30，41]。 其中SODs 可催化超氧自由基转化为H2O2和氧气[42]，PRXs 和GPXs 等可以将H2O2转化成H2O[43]。 松材线虫过氧化物酶基因BxPrx在松材线虫不同组织中大量表达并分泌到线虫体外，松材线虫侵染寄主后，其过氧化物酶基因BxPrx响应寄主H2O2积累而上调表达，体外H2O2处理后，BxPrx基因也显著上调表达[33－44]，BxPrx体外重组蛋白对H2O2具有较高的抗氧化活性。 通过RNAi 技术沉默BxPrx基因后，松材线虫繁殖率和致病性降低[45]。 另外，BxPrx在秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans中超表达后，秀丽隐杆线虫的抗氧化性增强[46]。BxPrx可能通过降低寄主环境中H2O2含量，提高松材线虫对活性氧的适应性，从而适应寄主高浓度活性氧环境[47]。

松材线虫自噬基因可能在松材线虫抵御寄主活性氧毒害中也发挥了重要作用。 松材线虫自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16在与寄主互作早期均有上调表达；过氧化氢处理条件下BxATG5、BxATG9和BxATG16均上调表达，通过3 －甲基腺嘌呤抑制自噬基因表达或沉默BxATG9和BxATG16后，松材线虫在过氧化氢处理条件下的取食、繁殖、卵孵化和活性均受到抑制，同时对寄主的致病性也降低；另外，松材线虫自噬基因可能与过氧化物酶和过氧化氢酶之间有协同作用，松材线虫自噬基因被抑制时，过氧化物酶和过氧化氢酶活性会增强[48]。 因此，松材线虫进化出多种策略应对寄主活性氧的损伤。

松材线虫活性氧耐受性与致病性有关，致病性越强的松材线虫虫株，对活性氧耐受性越强；对活性氧的耐受性可能还与角质层厚度等物理因素有关。致病性高的P9 株系在过氧化氢(H2O2)胁迫条件下的存活率高于致病性低的P3 株系，在松树苗上繁殖率也更高；致病性更高的虫株，其角质层更厚[49]。松材线虫对活性氧的耐受性在致病过程中发挥了重要作用，但其作用机制还需要深入研究。

为了应对松树萜烯类物质的抑制作用，松材线虫通过解毒作用对其进行代谢转化，降低其毒害作用，从而保证取食和迁移等整个病理学过程顺利进行[50－52]。 松材线虫的解毒作用可能分为3 个不同阶段:首先通过细胞色素P450 氧化还原作用给次生代谢产物加上功能团，使其更适合作为下游反应的底物；然后通过黄素单氧酶(FMO)、糖基转移酶、脂肪酸氧化酶、葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽转移酶、酸性磷酸酶、环氧化物酶等将有毒代谢物质转化为无毒物质[38－39]；最后通过ATP 结合转运酶等转运蛋白将中间代谢产物转运到线虫体外[52]。 在α－蒎烯和β－ 蒎烯胁迫条件下，松材线虫细胞色素P450、葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽转移酶、ATP 结合转运酶等相关解读基因大量上调表达[38－39]。 松材线虫细胞色素P450 代谢途径是松材线虫外源物质和毒素代谢的主要途径，在致病过程中发挥了重要作用[27，53]。CYP33C9、CYP33C4基因响 应 寄主α－蒎烯和β－蒎烯积累而大量表达，与寄主萜烯物质代谢存在明显的相关性，RNAi 沉默CYP33C9、CYP33C4、CYP33D3基因后，松材线虫活性、迁移率、繁殖率、致病性降低[54－55]。

综上所述，松材线虫无论是对松树活性氧的清除，还是对萜烯代谢的降解或利用，更多的还是现象和推测，这些不同解毒基因的作用机制及其相互作用还需要进一步研究。

1.3 松材线虫通过功能因子调节寄主防御反应

松材线虫与寄主互作过程中，分泌功能因子调节寄主防御反应，诱导寄主防御产物大量积累，最终导致寄主过度防御而死亡。 松材线虫功能因子主要包括毒液过敏原蛋白(venom allergen proteins，VAPs)、类甜蛋白(thaumatin-like proteins，TLPs)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine protease inhibitors，CPIs)以及其他可与寄主互作的功能因子。

线虫类毒液过敏源蛋白可能参与了其与寄主互作过程中胞间蛋白酶信号级联反应调节寄主防御反应[40]。 胞间蛋白酶信号级联反应可以调节植物对病原物局部和系统防御，该级联反应通过底物的蛋白水解过程传导信号激活下游反应[56]。 马铃薯胞囊线虫Globodera rostochiensis分泌类毒液过敏源蛋白，特异性抑制番茄类木瓜酵素半胱氨酸蛋白酶(papain-like Cys protease)Rcr3[57]，该抑制作用能诱导寄主防御相关基因的显著变化[58]，抑制植物免疫反应[59]。 线虫寄生过程中分泌类毒液过敏源蛋白的同时，还会分泌大量的细胞壁降解酶，类毒液过敏源蛋白可能参与调解细胞壁降解反应引发的防御反应[40]。 松材线虫类毒液过敏源蛋白(Bx －VAP1) 属于食道腺分泌蛋白，与松材线虫致病性紧密相关[60]。 松材线虫与海岸松Pinus pinaster互作过程中Bx－VAP1和Bx－VAP2大量表达[30]，RNAi沉默Bx－VAP1基因后，松材线虫在寄主体内的迁移率和致病力降低。Bx －VAP1基因体外重组表达产物诱导马尾松P.massoniana的α－蒎烯合成酶基因表达上调，α－蒎烯大量积累；寄主松树细胞质壁分离，细胞核降解，接种点附近部位出现细胞程序化死亡[61]。 因此，松材线虫Bx －VAP1基因可能具有调节寄主防御反应的作用，但具体如何调节还缺少直接的证据。

松材线虫类甜蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制剂可能通过模拟作用干扰寄主防御反应。 植物寄生线虫与寄主互作过程中，线虫会分泌模拟因子干扰植物信号通路，调解植物细胞发育过程。 植物寄生线虫分泌线虫CLE(CLAVATA3/ESR-like)肽链，与植物CLE 肽链具有高同源性，干扰寄主细胞增殖与分化过程，使寄主持续产生巨细胞，不断为寄生线虫提供食物[62]。 松材线虫分泌蛋白质组分析研究发现，松材线虫2 条类甜蛋白(thaumatin-like proteins，TLPs)和1 条类半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine protease inhibitors，CPIs)与寄主植物来源的蛋白同源性更高[63]。 单独克隆分析松材线虫Bx －TLP1、Bx－TLP2和Bx －CPI后，与动物源的蛋白相比，这3 条蛋白均与植物源蛋白同源性更高[64－65]。 接种松材线虫后，马尾松类甜蛋白基因(Pm－TLP) 与松材线虫类甜蛋白Bx－TLP1基因相对表达量存在此消彼长的关系。 因此，松材线虫Bx －TLP1基因可能模拟马尾松Pm－TLP基因的表达，进而影响松树萜烯物质含量[66]。 另外，Bx － TLP1、Bx － TLP2和Bx－CPI能诱导本氏烟细胞程序化死亡，松材线虫Bx－TLP1、Bx－TLP2和Bx －CPI可能通过分子模拟作用诱导寄主植物的过敏反应[67]，但这些基因是否模拟和如何模拟还需要进一步验证。

松材 线 虫 VAP、 TLP、 CPI 等 功 能 因 子 受STATAWAARS 启动子表达调控。 Espada 等发现了松材线虫新的启动子(STATAWAARS)[68]。 该启动子序列是松材线虫597 个基因的上游编码区域，约300 bp，大多数含有STATAWAARS 的启动子有一个调节区域，包含6 个元件的2 个激活子。该序列在松材线虫食道腺特异表达，与食道腺基因表达有关。 松材线虫食道腺大量表达的细胞壁降解酶(纤维素酶、β－1，3 －内切葡聚糖酶、果胶酸裂解酶、扩张蛋白等)、VAP 蛋白、TLP 蛋白以及CPI 蛋白酶等与STATAWAARS 的启动子有关[68]。

松材线虫还会分泌其他功能因子调控寄主防御反应。 松材线虫与黑松P.thunbergii互作过程中，松材线虫鞘脂类激活蛋白(sphingolipid activating proteins)基因BxSapB1在松材线虫侧腹腺中大量表达后，编码蛋白分泌到寄主组织中会影响寄主PR蛋白表达，可诱导本氏烟的细胞程序化死亡。 该基因沉默后寄主病程相关蛋白基因(PtPR － 1b，PtPR－3，PtPR －5)表达量降低且症状发生延迟。因此，该基因可能通过诱导寄主系统抗性在致病过程发挥重要作用[69]。 松材线虫BxSCD5基因也可抑制本氏烟中病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)触发的细胞死亡[15]，但没有更深入的研究。

为了在寄主体内成功定殖，松材线虫首先分泌大量细胞壁降解酶，破坏寄主物理防御；同时，通过分泌抗氧化酶和降解酶，消除植物H2O2或降解转化萜烯类物质等化学物质的毒害作用，保证线虫能在树体内成功取食、迁移、繁殖。 线虫分泌不同功能因子影响寄主次级防御反应，进而引起寄主过度防御而死亡，但这些蛋白基因的具体功能及如何降解转化或调节寄主的防御反应都还需要进一步验证和研究。

2 松材线虫伴生微生物在致病过程中的作用

2.1 产生植物毒素

松材线虫伴生微生物可产生植物毒素，间接影响松材线虫的致病过程。 从感病松树中分离的24株微生物中有17 株可以产生植物毒素，这些会产生植物毒素的微生物大多数被鉴定为假单胞菌[70]。荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens分泌的毒素是环二肽即鞭毛蛋白相似的肽链，对黑松树苗和细胞悬浮液均有毒性[71]。 该物质能促进松材线虫及其相关微生物繁殖，与未处理的黑松愈伤组织相比，鞭毛蛋白肽链处理后死亡的黑松愈伤组织更多，且愈伤组织中松材线虫和荧光假单胞菌数量更多[72]。单独用无菌松材线虫或拟松材线虫接种，均不能使黑松愈伤组织褐变和无菌黑松苗枯萎，而用无菌线虫与松材线虫携带的3 种细菌分别混合接种均能使黑松无菌苗及愈伤组织严重发病；表明在实验室条件下，人工接种幼苗病害的发生与松材线虫携带的细菌密切相关，而与线虫的种类关系不大[73]。 另外，分离自松材线虫的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereusHY－3 菌株能产生苯乙酸，促进黑松体内大量合成苯甲酸及其共轭物，诱导寄主死亡[74－75]。 松材线虫携带的树木伯克氏菌Burkholderia arborisKRICT1菌株会产生绿脓菌素，对赤松P.densiflora苗和愈伤组织都具有毒性，与芽孢杆菌诱导产生的苯乙酸相比，绿脓菌素毒性更强[6]。 分析35 株松材线虫伴生细菌对1 a 生海岸松的致病性发现，沙雷氏菌(Serratiasp. LCN －4、PWN －146)、肠杆菌(Enterobactersp. LCN － 25)、泛菌(Pantoeasp. PWN －128)能引起1 a 生海岸松针叶枯萎变黄[76]。 但这些研究都是在寄主愈伤组织或小苗上进行，其作用机制及其在田间大树上的结果具体如何还有待进一步验证。 截至目前，只是验证了少量的松材线虫伴生微生物具有产生毒素的作用，不足以完整说明松材线虫伴生微生物的致病作用[23]。 另外，接种无菌松材线虫或非无菌松材线虫后，无菌的赤松微扦插苗和马尾松实生苗产生萎蔫症状，而接种从松材线虫分离的细菌菌株后，赤松微扦插苗不枯萎；表明PWN 无菌并没有导致致病性的丧失[77]。 因此，松材线虫伴生微生物在松材线虫致病过程中的作用，还需要根据不同菌株、不同树种及不同立地环境具体问题具体分析。

2.2 分解植物化学防御物质

松材线虫伴生微生物可分解植物化学防御物质，消除寄主防御产物对松材线虫的抑制作用，从而有助于松材线虫致病作用。 松材线虫伴生微生物沙雷氏菌Serratiaspp. 、假单胞菌Pseudomonassp. 和窄食单胞菌Stenotrophomonassp. 等具有活性氧和萜烯降解活性，有助于松材线虫在树体内大量繁殖。松材线虫伴生沙雷氏菌对活性氧具有极强的抗性，可促进松材线虫在强活性氧逆境条件下繁殖，并且会影响松材线虫过氧化氢酶基因(Bxy－ctl－1和Bxyctl －2)的表达[78－79]。 假单胞菌P.yamanorum和P.extremaustralis的基因组中存在大量编码活性氧逆境相关酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、氧化还原蛋白、谷胱甘肽S－转移酶等的基因，可以帮助松材线虫抵御活性氧毒害[80]。 嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia与松材线虫共生过程中可以通过调控线虫寄生、免疫和致病相关基因的表达增强线虫的致病性和繁殖力[81－82]。 同样，荧光假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌可通过提高松材线虫的抗氧化酶活性，增强松材线虫在氧胁迫下的运动行为能力，增强了松材线虫的抗氧化能力，降低寄主体内活性氧含量[83]。 松材线虫接种马尾松12 h 后，基于16S rDNA 扩增子测序技术研究发现，具有外源性生物降解和代谢、萜烯和聚酮类物质代谢、运输和分解代谢等功能的微生物大量富集[84]。 通过转录组测序发现松材线虫可以代谢蒎烯等外源性有毒物质，但松材线虫本身缺少萜烯化合物降解的功能途径[53]，而在松材线虫伴生微生物的宏基因组中发现了α－蒎烯降解的完整途径[85]，说明松材线虫伴生微生物可能在其致病过程中对这些外源性有毒物质的降解和代谢起着重要作用，但无论是直接分泌植物毒素导致病害发生还是降解植物防御物质促进松材线虫致病的作用机制均还需进一步研究。

3 松树内栖微生物在致病过程中的作用

3.1 对松材线虫种群的影响

松材线虫病后期，松树彻底枯死后，松材线虫从寄生阶段转变为腐生阶段，以松树内栖真菌为食[50]，维持松材线虫种群生存和繁殖，为再次侵染提供可能。 灰葡萄孢Botrytis cinerea、长喙壳Ceratocystissp. 、色二孢Diplodiasp. 、盘多毛孢Pestalotiasp. 、大茎点霉Macrophomasp. 、镰刀菌Fusariumsp. 、Ophiostomasp. 、孢子丝菌Sporothrixsp. 、帚梗孢菌Leptographiumsp. 、木霉Trichodermasp. 等内栖微生物在体外培养条件下可促进松材线虫种群增长[86]；多孔菌Trichaptum abietinum、节丛孢菌Arthrobotryssp. 、条纹黏褶菌Gloeophyllum striatum、隐 孔 菌Cryptoporus volvatus、Ophiostoma ips和Ophiostoma minus、外生菌根菌Crytosporiopsissp. 、帚梗孢菌Leptographiumsp. 、盘多毛孢Pestalotiasp. 、大茎点霉Macrophomasp. 可在寄主体内促进松材线虫种群数量增长[86]。 不同地区病木内栖微生物存在种类差别，不同种类的内栖微生物对松材线虫种群数量具有不同的影响[87]。 松树常见内栖微生物灰葡萄孢和Sphaeropsis conigenus能显著促进松材线虫种群增长，松材线虫也能在松球壳孢菌Sphaeropsis sapinea、Ophiostoma ips、 帚 梗 孢 菌Leptographium terebrantis上 生 长[88]。 长 喙 壳 菌Ceratostomellasp. 、镰刀菌Fusariumsp. 等体外培养的松材线虫种群繁殖率显著比灰葡萄孢和盘多毛孢Pestalotiasp. 培养的高[89]。 松树内栖微生物在提供食物营养的同时，还会产生某些化学物质促进松材线虫的繁殖，影响媒介昆虫携带松材线虫的数量。 从灰葡萄孢中提取的类似激素的化学物质3 －辛醇和1 －辛烯3 －醇，对松材线虫具有引诱、促进蜕皮和繁殖作用，可能在促进松材线虫迅速繁殖过程中有重要作用[90]。 部分松树微生物表现出杀松材线虫活性，如Trichodermasp.3 菌株能显著降低松材线虫种群数量[91]。 从云南松P.yunnanensis内分离到一种杀线虫真菌Eysteya vermicola，能产生黏附性新月形孢子，粘附并寄生松材线虫，最终导致松材线虫死亡[92－93]。 因此，E.vermicola是寄主松树内栖真菌，同时还具有杀线虫活性。

3.2 松树内栖微生物多样性与松树抗性的相关性

松材线虫病侵染会影响松树内栖微生物多样性，松树内栖微生物的差异也影响其对松材线虫病的抗性。 松材线虫入侵后，诱导黑松[94]、马尾松等[95－96]松树内栖微生物丰富度及优势菌株发生变化。 Zhang 等[96]通过16S 扩增子研究发现，松材线虫侵染后，马尾松的内栖细菌类芽孢杆菌属Paenibacillus、伯克氏菌科Burkholderiaceae 的未定名属、沙雷氏菌属Serratia、欧文氏菌属Erwinia、假黄色单胞菌属Pseudoxanthomonas和内栖真菌Penicillifer属、接合囊酵母属Zygoascus、Kirschsteiniothelia属、Cyberlindnera属和孢子丝菌属Sporothrix的丰富度均高于健康马尾松。 抗性松树湿地松Pinus elliottii、加勒比松P.caribaea和火炬松P.taeda与感病松树马尾松内栖微生物存在显著差异。 抗性松树中热酸菌属Acidothermus和普雷沃氏菌科Prevotellaceae 含量较高，欧文氏菌属含量较低。 而感病松树中欧文氏菌属含量较高。 这些说明了松树内栖微生物的多样性和丰富度与松材线虫病发生过程中存在相关性，但具体哪些种类关系更为紧密，其作用程度以及作用机制还需深入研究。

4 结语

关于松材线虫的致病机理一直是松材线虫病研究的热点，近十多年该领域的研究富有成就，研究者们从不同角度给予了探索，取得了许多进展，明确了许多基本问题。 如大量的研究表明松材线虫是松材线虫病的病原，是病害的直接致病因素；并且在确定病原的基础上，利用基因组、转录组、RNA 测序、蛋白质组及RNAi 技术对松材线虫一些基因进行了功能验证分析，但由于寄主松树生长周期长、遗传背景不清楚、且寄主转基因体系不够成熟，很难对其进行模式化研究；同时由于松材线虫体型较小且雌雄异体，很难获得性状稳定遗传的纯合虫株给基因编辑带来了困难。 因此，目前的研究更多的只是在其他模式生物如本氏烟和秀丽隐杆线虫中进行验证，还缺乏松树与松材线虫互作体系中获得致病基因作用的直接证据，由此限制了松材线虫致病机理的研究。因此，建立寄主松树与病原松材线虫转基因体系是松材线虫致病机理研究急需解决的技术问题。 基于有效的互作体系，筛选寄主松树与松材线虫直接互作因子，多层次多水平系统地研究松材线虫多基因协同致病机理是松材线虫致病机制未来研究的主要方向。

同时大量的研究也表明，松材线虫伴生微生物或松树内栖微生物对松材线虫的生命活动有重要影响，它们可间接地对线虫的致病性产生加强或减弱的作用。 如研究推测松材线虫伴生微生物分泌植物毒素或通过分泌降解松树防御物质从而促进松材线虫的致病，发现松材线虫侵染影响松树内栖微生物的群落变化及不同抗性松树微生物群落差异显著等。 这些结果给我们进一步针对松材线虫致病机理研究提供了新的思路，这些微生物群落结构在其致病过程中的作用到底如何? 又是哪些微生物种群在起作用，哪些是核心菌群及其如何作用，这些可以在通过基因编辑研究松材线虫致病分子机理的同时开展研究，共同推进松材线虫病的研究。 此外，发现一些松树内栖微生物被证明促进繁殖或具有杀线活性，但该结果更多的是实验室室内或在幼苗上试验，在田间效果如何，是否在多种松树上定殖，在松材线虫致病过程中是否起关键作用及其作用机制还有待深入研究。