松材线虫检测技术研究进展

李敏，叶建仁，陈凤毛

(南京林业大学林学院，南方现代林业协同创新中心，江苏南京 210037)

松材线虫病(pine wilt disease)又称松树萎蔫病，其病原是松材线虫Bursaphelenchus xylophilus(Steiner ＆Buhrer) Nickle[1－2]。 松材线虫起源于北美洲[3]，我国于1982 年首次在南京中山陵的黑松Pinus thunbergii上分离到松材线虫[4]。 此后，松材线虫病在我国呈持续扩散蔓延态势，造成严重经济损失[5]。 随着该病害向高纬度地区扩散，对我国高纬度、高海拔地区的松林资源威胁进一步加大[6]。40 年来，我国松材线虫病疫情尚未得到根本性的控制。

松材线虫病防控的首要措施是检测与监测。 在我国发生松材线虫病的前20 年，疫情监测难以真正在基层开展，不能做到及时发现、及早除治。 疫木控制更是因为没有可行的快速检测技术，人为传播现象严重。 因此，松材线虫的检测鉴定工作十分重要，致力于快速、准确、便捷的病害诊断技术的研究工作一直在不断推进。

1 基于形态学特征的检测方法

松材线虫的形态学检测是一种在显微镜下观察和分析形态特征的传统检测方法[7]，根据线虫的体长、尾长、尾尖突形状、中食道球的宽度、阴门的位置以及阴门盖的有无等特征对线虫进行鉴定[8]。

形态学检测方法是最基本的鉴定方法，不需要贵重的仪器与设备，投入成本相对较小。 生产、科研、教学单位常采用该方法。 但是，形态学鉴别也有其自身的不足，最大难点在于区分与松材线虫同属的其它伞滑刃线虫，尤其是与拟松材线虫Bursaphelenchus mucronatus的区别难度最大。 在形态学特征出现重叠的情况下，鉴定往往带有主观性。 此外，通过形态学方法几乎难以确定幼虫和雄成虫的种类。 因此，形态学检测需要检测人员具备丰富的线虫学专业知识背景和实践经验。 形态学检测的时间相对较长，在没有发现分离样品中存在典型雌成虫的情况下，需要对所分离的样品逐一观察，有时需要培养至成虫出现再进行鉴定。

2 基于分子生物学的检测方法

鉴于形态学鉴定存在的不足之处，研究人员先后研发了以核酸为基础的松材线虫分子生物学检测方法。 主要有限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、序列特异扩增区域(sequence characterized amplified region，SCAR)、巢氏PCR(nested PCR)、实时荧光定量PCR(real-time PCR)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、重组聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)等。

2.1 RFLP 技术

20 世纪80 年代Lander 等[9]最早提出将RFLP标记方法用于区别不同物种。 由于不同物种的DNA 序列结构不同，内切酶的识别位点以及数目不同，其被不同种类的限制性内切酶酶切后，所表现出的凝胶电泳图谱必然会反映物种间的差异。

在松材线虫与其近似种的区别方面，很多学者利用ITS－RFLP 技术进行了探索[10－17]。 其中发现DraI 酶能够酶切松材线虫群体，产生两个长度分别约510 bp 和380 bp 的片段，而近似种拟松材线虫群体均不能被DraI 酶切；此外，SalI 酶不能酶切松材线虫群体，但拟松材线虫群体均能被酶切为两条720 bp 和220 bp 的片段。 因此，内切酶DraI、SalI可以很好地用来区分松材线虫与拟松材线虫这两个近似种。

RFLP 是分析植物寄生线虫种间和种下群体遗传变异的有效工具。 但该方法所需操作步骤多，整个分析过程耗时过长，操作程序过于复杂。 此外，实验对提取的线虫DNA 有较高的要求，须保证DNA的纯度。

2.2 PCR 技术

1)常规PCR。 Mullis 最早于1983 年提出聚合酶链式反应设想，1985 年PCR 技术诞生[18]。 此后，该技术成为最常用、最重要的分子生物学技术之一。DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA 在高温时发生变性解链成为两条单链，在低温时两条单链又可复性成为一条双链。 因此，可通过温度升降变化来控制DNA 的变性和复性，从而可实现某特定基因的体外复制，即PCR 技术。

PCR 技术的应用，使植物寄生性线虫的分子诊断和致病性的基础研究发生了质的变化。 基于序列差异的分子诊断方法已成为植物病理学的一种通用方法。 常规PCR 已广泛应用于系统发育研究、种源鉴定研究和致病基因探索等领域。 使用PCR 技术可通过扩增特异性区域来区分形态类似的线虫[19]，采用不同的引物进行检测，将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳仪验证后可以提高线虫鉴定的灵敏度。 与其它分子生物学技术相结合，将充分发挥PCR 在特定物种鉴定方面的作用。 该技术还可以实现对待测样品的批量检测。 PCR 检测技术的核心是用于检测物种的引物是否具有特异性，这需要在长期的实践中进行检验。 常规PCR 检测也需要借助凝胶电泳进行判断，这也需要较长的时间，并非真正意义上的快速检测。

2)巢式PCR。 常规PCR 在对模板进行扩增的过程中，引物与模板之间会出现非特异性配对，导致产生非特异性产物。 为提高PCR 扩增的特异性，Lee 等[20]对常规PCR 进行技术改良，发明了巢式PCR。 它是通过增加和扩增一组引物来提高PCR的特异性。 第1 对引物称为普通PCR 引物，第2 对引物称为巢氏引物。 首先使用普通PCR 引物进行扩增，然后针对第一次PCR 扩增产物使用巢氏引物进行第二次扩增，这使得第二次PCR 扩增的片段要短于第一次扩增。

2011 年，Huang 等[21]构建了以拓扑异构酶Ⅰ为靶点的松材线虫特异性巢式PCR，对44 株形态特征明显的线虫株系进行了检测，包括松材线虫、拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫Bursaphelenchus hofmanni、吴氏长尾线虫Seinura wuae、李氏长尾线虫Seinura lii和大核滑刃线虫Aphelenchoides macronucleatus，所有松材线虫株系均有509 bp 扩增产物。该巢式PCR 体系可以检测到50 fg 模板DNA 或一个卵大小的线虫个体。 通过对田间线虫侵染木材中提取的线虫样品分析，该方法是一种特异性强、灵敏度高的检测方法。

巢氏PCR 的优点是特异强，即使提取线虫DNA 的量非常少，也能扩增特异性区域。 但如果第一次扩增发生错误，第二次就无法成功扩增，该方法很难同时检测和区分多种病原物。

3)实时荧光定量PCR。 1989 年Choo 等[22]研发了实时荧光定量PCR 技术，也称为RT －PCR 或qPCR(quantitative PCR)。 在PCR 反应体系中加入荧光染料或者带荧光基团的探针，利用每次扩增循环后荧光信号的加倍积累，实时监测PCR 进程，对标标准曲线，从而实现对物种未知模板初始含量的分析。

RT－PCR 已经发展成为一种较为常用的线虫种间鉴定方法[23－24]。 陈凤毛 等[25]以松材线虫的rDNA 内部转录区为靶标，设计了一对实时荧光定量PCR 引物和特异探针，构建了松材线虫实时荧光定量PCR 检测方法。 特异引物组合F11/R11 与探针TaqMan－11 能够较好地区分来自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属Seinura线虫。 在10 μL 的反应体系中，能够检测出0.005 pg 的物种DNA 含量。表明该技术具有灵敏、准确等优点。 RT －PCR 存在的不足主要是实验过程相对较为耗时，且相关试剂和设备较为昂贵。

2009 年南京林业大学线虫创新研究团队在原有实时PCR 检测技术的基础上，进一步优化高效线虫裂解液，实现对松木样本中的线虫直接进行组织裂解释放DNA；同时对线虫特异性片段检测过程、结果判读和报告输出等环节进行自动化设计，研制出松材线虫专项自动化检测系统。 该系统已在全国20 多省推广应用。

2.3 基于PCR 技术的分子标记

1)RAPD 技术。 20 世纪90 年代，Williams[26]和Welsh[27]等研发了RAPD 分子标记。 其引物是一条10 bp 的寡核苷酸单链随机引物。 通常在物种的基因组中，每2 000 bp 长的序列内约有10 个左右的反向重复序列，在两条模板DNA 单链上就可能各有1 个引物的结合位点，若2 个结合位点间的序列在3 000 bp 的长度范围之内，便可扩增出该引物的谱带。 通过不同的随机引物就可以检测到覆盖整个基因组的位点，由此反映出该物种的真实多样性。

RAPD 技术也曾用于线虫检测。 Braasch 等采用RAPD－PCR 技术对松材线虫及其近似种拟松材线虫的遗传多样性进行研究[28－31]。 Braasch 等发现随机引物OPY－01、OPB－7N、OPPZ－08 能区分松材线虫、假伞滑刃线虫B.fraudulentus和拟松材线虫。 陈凤毛 等[32]研究发现随机引物OPK09 与随机引物组合OPC18 ＋OPN18 可以很好地区分松材线虫和拟松材线虫。

RAPD 所含信息量大，图谱比较复杂，对实验反应体系和条件要求严格，扩增灵敏，重复性相对较低。 在物种鉴定(包括松材线虫检测)上存在一定难度。

2)SCAR 技术。 该技术是Paran 等[33]在RAPD技术的基础上发展的一种新的分子标记。 在物种特异的RAPD 片段序列上设计一对24 个碱基的互补引物，并对原来的模板DNA 扩增，特征序列扩增区域(SCARs)即被扩增检测到。

SCAR 标记在品种的抗病检测、种质鉴定等多领域广泛应用[34－36]。 陈凤毛 等采用SCAR 标记构建了松材线虫检测试剂盒，其检测的灵敏度达到1/7条线虫，并实现了对幼虫的准确检测[37]。

SCAR 标记可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。 但该方法程序多，完成全部检测过程需要2.5 ～3.0 h。

2.4 环介导等温扩增(LAMP)

LAMP 是Notomi 等[38]研发的一种新的核酸扩增方法。 不同于PCR 仅需要设计上、下游引物，LAMP 则需要设计包括外引物、内引物等4 ～6 条引物。 仅需要在60 ～65 ℃的恒温下，利用具有链置换效应以及识别延伸效应的BstDNA 聚合酶，对目的片段进行大量且快速的扩增。

LAMP 技术自开发以来，已经在国内外医学病原物检测、食品安全检测及基因芯片等方面有广泛的应用且效果良好，近些年也逐渐应用到植物病原检测领域[39]。 在LAMP 扩增产物中，添加SYBR Green I 染料，以便于对检测结果的判读。 目前常通过ITS 区段、β－actin 区段、果胶酸裂解酶3 基因和expansin-like 基因检测和区分致病线虫是否为松材线虫[40－41]。 据Kikuchi 等[42]报道，日本开发了一种商业化的、用LAMP 方法检测松材线虫的试剂盒，诊断结果需要1.5 h 左右。

LAMP 操作简单、成本低廉且设备需求不高，不需要昂贵的仪器设备即可用于具有荧光样品的现场检测。 然而LAMP 扩增的产物不是连续的片段，这使得克隆或在其他方面的应用变得局限。 在高温和长时间放大过程中，由于阳性样品的气溶胶交叉污染，有可能获得假阳性样品。 此外，通过颜色判读结果，也存在一定误差。

鉴于颜色判别存在的主观差异问题，南京林业大学于2009 年在LAMP 技术基础上，成功研发了CPA(crossing priming amplification) 技 术。 该 技术具有灵敏度高、特异性强、易于判读、检测设备简单、一次性投资低廉、易于普及等优点。 目前已在浙江、江苏、上海、四川、重庆、安徽、山东等7 省推广应用。

2.5 重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)

RPA 是TwistDx Inc 公司于2006 年开发的一项技术[43]。 该技术主要依赖于能结合单链核酸(寡核苷酸引物)重组酶T4 UvsX、单链结合蛋白(SSB)和链置换DNA 聚合酶等。 重组酶与扩增引物结合形成重组酶引物复合体，插入双链DNA 形成D －环结构，启动链置换反应。 SSB 蛋白与解开的DNA链结合防止进一步被置换。 重组酶从复合体中被水解，3′端引物暴露并与DNA 聚合酶结合，DNA 开始复制延伸，2 条母链分离，形成2 条新的互补双链DNA，从而实现对模板上的目标区域进行指数式扩增。

RPA 不需要热变性，也不需要温控设备。 在23 ～45 ℃条件下，20 min 内即可完成扩增过程，实现快速检测目标。 可与实时荧光检测、侧向层析和凝胶电泳以及桥联絮凝分析、比色反应、电化学转导、电化学生物传感器、硅微环谐振器(SMR)光子检测和表面增强拉曼散射(SERS)等检测方法结合，以实现快速检测[44]。

Cha 等[45]将便携式光学等温装置(POID)，结合应用松木中松材线虫gDNA 的快速提取缓冲液(DAP buffer)，进一步简化检测程序，能在田间25 min内完成松材线虫病诊断，实现对松材线虫的现场检测。 用于检测松材线虫的POCD－RPA 将有助于该领域的流行病学调查以及木材贸易的检疫过程。 对于没有线虫专业知识背景的人员而言，该检测方法相对容易，且检测结果比较准确，但需要专用检测设备。

3 基于蛋白的检测方法

蛋白在生物体中起着非常关键的作用，如参与细胞的增殖分化、能量转换或信号转导等。 膜蛋白的分布并不均匀，而且特定物种之间存在较大差异，因此不同物种的蛋白就相当于一个独特身份的“条形”码，通过分析蛋白的表达水平和表达模式可以确定线虫的种类和不同线虫的种间差异[46－47]。 从树体分离的线虫中提取蛋白后，可通过蛋白质序列差异分析、同工酶分析(isozyme analysis)、二维凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DGE)和蛋白飞行时间质谱技术等较为成熟的技术手段，对线虫进行鉴定。

3.1 双向凝胶电泳(2-DGE)

该技术是由Farrell、Klose 以及Scheele 等人于1975 年发明[48]。 其原理是第一向基于蛋白质的等电点不同，在一个稳定和连续的pH 梯度中进行分离和分析，具有相同等电点的蛋白质无论分子大小，均会聚集在其特定位置；第二向则按分子量的不同，用SDS－PAGE 分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面分开。 因此，根据不同线虫种类间所含蛋白质分子的大小及质荷比等差异，可用双向凝胶电泳分离技术进行鉴定。 Fu 等从松材线虫和拟松材线虫中提取蛋白后，采用双向凝胶电泳技术比较了这两种物种间的蛋白质表达模式，与拟松材线虫相比，在松材线虫中共鉴定出15 种高表达特异蛋白[49]。

双向凝胶电泳的优点是快速、分辨率高，同时也是唯一能够将上千种蛋白质同时分离和展示的技术。 其缺点也很明显，通过分离的蛋白数量和观察到的多态性结果取决于使用的程序和分析的样品数量，有时很难对蛋白斑点进行区分，因为很难评估观察到的相似或差异是真实的还是凝胶形变导致的，操作较为复杂。

3.2 同工酶分析

Dias 等1994 年描述了同工酶分析技术[50]。 同工酶作为一类蛋白质，广泛存在于生物中，其主要分离方法有电泳法、层析法、酶学法和免疫学法，其中以电泳法应用最为广泛[51]。 从线虫中提取可溶性蛋白后，对其特定的同工酶进行染色，根据不同同工酶的分子结构、活性以及免疫原性等特异性，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析法可对不同线虫物种进行鉴定。 胡凯基等对松材线虫和拟松材线虫的酶电泳进行分析，结果表明其苹果酸脱氢酶谱、纤维素酶谱和酯酶谱等有差异，但并不稳定，只有谷氨酸草酰乙酸转氨酶可将松材线虫和拟松材线虫成功区分[52]。尽管目前苹果酸脱氢酶、超氧化物歧化酶等在线虫蛋白检测中被使用，但该方法操作繁琐且费时，必须有一个已知样品作为参考，因此使用较为受限。

3.3 蛋白飞行时间质谱技术

该技术是一种精确测定物种蛋白质质量的新型技术，又称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization － time of flight mass spectrometry，MALDI － TOF MS)，由Karas 等于1987 年发明[53]，其原理是将不同物种或种群间蛋白质谱中产生的特定峰作为生物标记来鉴定不同物种。 Fu 等[49]通过双向凝胶电泳比较了松材线虫和拟松材线虫的蛋白表达，并使用MALDITOF/TOF 对强度出现差异的15 个蛋白斑点进行了分析，鉴定出松材线虫特有的蛋白。 双向凝胶电泳技术和蛋白飞行质谱技术联用为线虫分类提供了一个强有力的工具，但其结果会受到诸多因素的影响，包括蛋白的提取方法、双向凝胶电泳结果的质量以及仪器的操作准确性等，线虫的不同龄期和生长条件也会导致表达谱的变化[54]。

4 展望

松材线虫形态鉴定是基本的方法，是其他检测方法的基础。 鉴于形态鉴定的缺点而研发高效率的各种分子检测方法，面临的最核心问题就是检测的准确性。 多种近似种以及超大样本量对研发分子检测技术具有决定性作用。 准确性还取决于后期实践检测过程中的不断检验。 目前，南京林业大学建有国内唯一的松树寄生线虫虫株资源库，也是国内外松树寄生线虫虫株数量最多的虫株资源库，收集有全国各疫区松材线虫虫株资源，其中松材线虫虫株460 个，拟松材线虫虫株110 个，其他松树寄生线虫虫株140 个。 该虫株资源库为松材线虫分子生物学检测方法的研发提供了坚实的支撑。

20 世纪末期，RFLP、RAPD、SCAR 等技术，对推动松材线虫种类鉴定起到了积极作用，但由于这些技术存在复杂性、重复性、操作程序和检测时间等问题，没有真正在生产实际上广泛应用。

2006 年，我国研发出的松材线虫分子检测技术成功应用于生产实践，并在全国推广应用。 尤其是2009 年研发出松材线虫自动化分子检测鉴定技术，实现了松材线虫病分子检测技术在我国各省市县的推广和普及化，依靠该检测技术，结合形态学方法，基本解决了我国松材线虫病检疫和监测过程中的鉴定技术难题[55－56]。

近年来兴起的LAMP、POCD －RPA 等检测方法，在检测便利性、检测时间、检测成本等方面都具有较大的优势。 但这些方法还需要在生产实践中继续检验。 基于蛋白质的方法为今后物种鉴定提供了一种可期待的研究方向。 但确定蛋白表达模式需要繁琐的实验步骤，提取的蛋白也比较容易降解，这可能会影响判断的准确性，这也是该方法难以大量应用的主要原因。

在松材线虫病感染初期，树体基本没有病症显现，无法精准判断林间树体是否感病，通过传统分子生物学检测方法和基于蛋白的检测方式判断林中疫木较为困难；一旦植物感病晚期相关症状开始出现时，基本已无法治疗。 因此，在松材线虫病侵染初期未显现症状的松林同样需要快速检测和治疗，未来可通过基于树体外观症状、线虫形态学、DNA 以及蛋白的检测方法与化学或物理检测方式(如感染松材线虫病的标志性挥发性气体、树体外观光谱学分析或树体导电率差异等)相结合，以实行快速有效的检测。