艳山姜果实质量标准研究

谢泽碧，洪影雯，梁子宁，卢 莹，罗 敏，韦丽翠

（广西中医药大学，南宁 530001）

艳山姜［Alpinia zerumbet（Pers.）Burtt.et Smith］别名有假砂仁、草豆蔻、大良姜、土砂仁等［1，2］，习惯药用部位是其成熟干燥的果实，性温，味辛、涩，归于肺、大肠、脾和胃经［3］，功效有温中、行气、燥湿、止痛、截疟等［4］，可以用来治疗胃脘胀痛、胸腹胀满、脾胃虚弱、肠鸣泄泻、疟疾等疾病［5］。多分布在中国东南部及西南部地区，习惯生长在海拔100～1 000 m的溪边丛林及草丛、阔叶林中［6，7］。目前，从艳山姜中分离出来的化学成分多达200余种，主要为挥发油、黄酮、甾体类和有机酸类等组分［8-13］。

目前，对艳山姜的研究主要集中在叶、根、茎的性状［14］、多糖提取［15］及挥发油等方面［16-19］，鲜见果实质量标准方面的报道。此外，还有报道称艳山姜果实主要的药理活性成分为挥发油，但究竟为蒎烯、乙酸龙脑酯还是黄酮类等化合物起作用还是综合成分起作用并不明确，因此本研究对艳山姜进行观察鉴别、常规性检查、浸出物含量测定以及挥发油含量的测定，以期为艳山姜果实在临床用药中能做到安全、有效、可控，以及质量标准的建立奠定试验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试药及试剂药材采自广西壮族自治区（以下简称广西）多个产地（表1），共11个批次，分别编号为YSJ-1至YSJ-11，其中YSJ-3为对照药材。经广西中医药大学药用植物教研室韦松基教授鉴定为姜科植物艳山姜的成熟果实。

表1 艳山姜果实采集信息

乙酸龙脑酯、乙酸乙酯、甲醇、无水乙醇等均为分析纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 主要仪器ZF-20C型暗箱三用紫外分析仪（上海精密仪器仪表有限公司）；EclipseE200MV型尼康生物显微镜（南京横桥仪器有限公司）；GC7890A型气相色谱仪、MS5975C型质谱仪（美国Agilent科技公司）；挥发油提取器、中药粉碎机等。

1.2 方法

1.2.1 药材性状鉴别艳山姜成熟果实为蒴果（图1），具明显粗毛，呈类球形，长1.0～2.5 cm，直径1.0～2.5 cm，有12～18条隆起；顶端常有宿存花被，底部有果梗；果皮棕色或黄棕色，皮薄、较软，一层白色隔膜把果皮和种子分隔开成3瓣，每瓣有3～8颗种子；种子易散落、呈不规则多边体，直径0.3～0.5 cm，表面有白色的薄膜，拨开薄膜呈黑色、表面光滑、较硬，断面有油性，气微芳香、味微辛。

图1 艳山姜果实

1.2.2 横切片显微鉴别艳山姜果实横切片呈圆形（图2），表面有许多毛茸，多为非腺毛，红棕色为主，基本薄壁组织中有较多的油细胞（图3），其胞腔具棕黄色油滴，其他薄壁细胞内可见较小的草酸钙方晶和淀粉粒；维管束分散排列在果皮薄壁组织中，20～25个维管束呈同心环状，整个切片具2～3个同心环。由图2可知，果实为3心皮，3个子房室，中轴胎座，每室3～8颗种子不等。

图2 艳山姜果实横切片

图3 艳山姜果实显微结构

1.2.3 粉末显微鉴别艳山姜果实粉末显微特征见图4。样品粉末呈棕色或棕黄色，纤维较多、单个或成束、顶端较钝，长750～405 μm。非腺毛众多，单细胞、多细胞均有散在，长约80～390 μm。石细胞较多，单个或成团，呈多边形，长约35～350 μm，宽约20～235 μm。可见内、外果皮，且外果皮上具非腺毛的短痕。淀粉粒较少，常呈单粒或复粒，多为类圆形，大小约0.5～25.0 μm。草酸钙方晶较少，长约0.5～15.0 μm，宽约0.5～10.0 μm。螺纹导管较少，直径约1.1～3.5 μm。

图4 艳山姜果实粉末显微特征

1.2.4 不同批次艳山姜药材挥发油含量测定称取艳山姜果实50 g，利用中药粉碎机适当粉碎至种子破裂，在圆底烧瓶中装入粉碎后的艳山姜果实和500 mL蒸馏水，连接挥发油提取器。从冷凝管上部添加蒸馏水直到没过挥发油提取器的刻度部分，保持混合液微沸状态5～6 h，直至油量停止增加，则停止加温，待稍冷却后收集挥发油。参考《中国药典（四部）》挥发油测定法［20］，测定11批药材的挥发油含量。

1.2.5 艳山姜挥发油对照品溶液制备用分析天平分别精密称取乙酸龙脑酯5 μL、3.00 g作对照品，对应加入无水乙醇0.5、10.0 mL，制成10 μL∕mL的对照品溶液①和0.3 g∕mL对照品溶液②。

1.2.6 艳山姜挥发油供试品溶液制备精密称取11批药材粉末各1 g，分别加入甲醇5.0 mL，超声处理10 min后进行提取、过滤，取上清液置于2 mL容量瓶，制成供试品溶液①。分别量取11批药材挥发油100 μL，用乙酸乙酯稀释，定容至10 mL容量瓶中，即得供试品溶液②。

1.2.7 GC-MS仪器联用

1）色谱条件。HP-5MS石英毛细管柱（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm），程序升温：初始温度50℃，以5℃∕min升温至120℃，保持2 min，以6℃∕min升温至260℃。运行时间为43 min。柱流量：1 mL∕min。柱温100℃，进样口温度250℃，检测器（FID）温度250℃，分流比为10∶1。

2）溶液制备。参照“1.2.6”对照品溶液②、供试品溶液②方法制备。

2 结果与分析

2.1 薄层鉴别

参考2015年版中国药典（四部）通则（0502）薄层色谱法，用移液枪吸取对照品溶液①、供试品溶液①各6 μL，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-乙酸乙酯（13-2-2）作展开剂。取出晾干后，在365 nm处观察（图5），结果表明，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且斑点显色清晰集中。

图5 11批艳山姜果实粉末薄层色谱

2.2 检查

2.2.1 水分参考《中国药典（四部）》（通则0832）方法进行水分测定［20］，11批艳山姜药材水分为6.93%～15.72%（表2），多数在11%以下，初步拟定艳山姜果实药材水分不得超过15.0%。

2.2.2 总灰分、酸不溶性灰分参考《中国药典（四部）》（通则2302）方法进行总灰分和酸不溶性灰分测定［20］，11批艳山姜药材总灰分范围为5.35%～6.80%，均在7.0%以下，结合实际应用考虑，初步拟定总灰分不得超过8.0%。试验发现酸不溶性灰分为0.93%～1.81%，大部分在1.5%以下，初步拟定酸不溶性灰分不得超过1.9%（表2）。

2.2.3 醇溶性浸出物参考《中国药典（四部）》（通则2201）方法进行醇溶性浸出物测定［20］，11批次艳山姜药材的浸出物含量为5.65%～12.17%（表2），均在5.5%以上，结合实际应用考虑，初步拟定醇溶性浸出物不得低于5.0%。

表2 11批艳山姜药材的检查项测定结果（n=3）（单位：%）

2.2.4 膨胀度参考《中国药典（四部）》（通则2101）的膨胀度测定法［20］，以无水乙醇做溶剂，3个批次艳山姜药材的膨胀度为2.89～3.74 mL∕g（表3），结合实际应用考虑，初步拟定艳山姜药材膨胀度不得低于2.80 mL∕g。

表3 艳山姜膨胀度测定结果（n=3）

2.3 挥发油含量测定与分析

2.3.1 含量测定参考《中国药典（四部）》（通则2204）挥发油测定法［20］，测定11批药材的挥发油含量（表4）。11批艳山姜药材平均挥发油含量范围为0.85%～1.32%，均在0.80%以上；大部分在1.00%以上（包括1.00%）；11处产地艳山姜药材挥发油的平均含量为1.04%；因此，结合实际应用考虑，拟定挥发油含量不得少于0.80%。

表4 11批艳山姜药材挥发油含量 （单位：%）

2.3.2 GC-MS联用分析对11批药材使用GC-MS仪进行分析，通过色谱峰面积归一化法，定量分析挥发油中的11个含量较高、相对百分含量靠前的化学成分（表5）。

表5 不同产地艳山姜果实挥发油的主要化学成分及相对含量

经GC-MS仪器联用，测定11批艳山姜果实挥发油，结果表明，β-蒎烯成分相对含量最高，其次是桧烯和桉叶油醇等。据文献报道，β-蒎烯药理作用有消炎抗菌、抗氧化、抗癌、抗痉挛、抗抽搐等作用［20］；水芹烯具有杀弧菌、镇痛消炎、抑菌等功效［21，22］；α-蒎烯具有润肺下气、化痰止咳、消炎抗菌等功效［23-25］，即3种主要化学成分与艳山姜果实的功效主治具有一定相关性。

由测定分析可知，艳山姜果实挥发油中乙酸龙脑酯含量低，故根据文献［26］，艳山姜与其他姜科植物不同，薄层鉴别中以其作为定性指标的选择还需进一步考察。

3 小结与讨论

通过对广西多地的艳山姜果实药材进行性状、显微鉴别和薄层色谱鉴别，发现其鉴别特征均明显、稳定，可作为艳山姜果实药材的鉴别依据。

前期预试验考察了多种展开系统、点样方式、多种显色剂、药材取样量、多种吸附剂及环境温湿度，得出了稳定且可靠的薄层鉴别方法。在本研究的薄层色谱试验中，以环己烷-氯仿-乙酸乙酯（13-2-2）为展开剂，在波长365 nm处观察，发现色谱分离度好、斑点清晰，斑点色彩层次分明。对11批艳山姜药材水分、灰分及浸出物等进行测定，依据试验结果，建议本品含水量限度不超过15.0%；总灰分限度不超过8.0%；酸不溶性灰分限度不超过1.9%；醇溶性浸出物限度不少于5.0%；膨胀度不低于2.80 mL∕g。

不同产地艳山姜药材挥发油含量有较大差异，广西11处产地艳山姜果实药材挥发油的平均含量为1.04%。因不同的生产地和不同的采收时间药材挥发油含量不同，结合实际应用考虑，建议按干燥品计算，挥发油含量不低于0.80%。文献报道艳山姜挥发油具有显著的抗炎镇痛、调节血脂、抗氧化作用［27］，可以作为艳山姜果实基于生物效应组分的质控标准之一。由GC-MS仪器联用分析可知，艳山姜果实挥发油主要由β-蒎烯、桧烯、桉叶油醇、蒎烯等化学成分组成，乙酸龙脑酯含量较低，在前期薄层鉴别中以其作为定性指标的选择还需进一步考察。

综上，本研究方法简便易行、复现性较好、特征明显、无干扰、耐用性强，可以作为艳山姜果实药材的鉴别方法，有利于其临床用药的安全、有效、可控，并为提升艳山姜的质量标准提供科学依据。