家蚕嗅觉蛋白研究进展

徐 柯 焦 锋

(西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100)

昆虫可以高效利用生物传感器进行各项生命活动，依靠化学物质的传递以指导其生理行为。昆虫外周的特殊结构(如触角)接收信息素和其他信息化学物质，是与大脑中的其他刺激方式整合并随后转化为行为的重要一步。然而通常情况下，参与化学通讯的信息化学物质在空气中浓度极低，还可能会与生理上不相关的复杂混合物混合在一起。为应对此类情况，昆虫的嗅觉系统逐步变得更加敏感且具有高度选择性，需要多种蛋白的参与，主要包括气味结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)、信息素结合蛋白(Pheromone-binding proteins，PBPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、气味受体蛋白(odorant receptors, ORs)等。

家蚕作为鳞翅目模式昆虫，是以桑叶为食的寡食性经济昆虫，利用嗅觉寻找桑叶的挥发性物质进行定位，并通过味觉试咬来判断是否适口来确定是否采食；繁殖交配期，雌蛾会释放性信息素，雄蛾通过性信息素的气味寻找雌蛾进行交配。因此，嗅觉器官对于家蚕的个体生存和种群繁衍都具有至关重要的作用，也是人们目前试图改良和利用家蚕的重要方向。比如，改变嗅觉器官的感受性来提高家蚕对于人工配合饲料的适应性，是未来轻简省力工厂化养蚕的基础，也是广食性家蚕品种培育面临的重要基础问题。近年来，利用家蚕基因组和遗传操作取得的重大进步，对家蚕嗅觉器官有了更多的认识了解。本文试图总结近年来的研究进展，并对未来研究方向提出看法。

1 家蚕嗅觉系统

家蚕(Bombyxmori)为寡食性昆虫，通常仅以桑叶为食。但有研究发现，家蚕在饥饿状态下也采食其它植物，如拓树、桑橙、构树和榕树等桑科植物。此外，家蚕也采食榆科、菊科、荨麻科等类植物[1]。家蚕的采食一般分为五个主要阶段：宿主植物的识别与定位；初食或“尝”；进食；持续进食；停止进食、休息、活动。

家蚕通过嗅觉感受器识别环境中的挥发性气味，从而进行觅食、交配和产卵等生命活动。根据形态特征，嗅觉感器主要被分为毛形感器、刺形感器、栓锥形感器、腔锥形感器和板形感器等。主要的两类感器是锥形感器和毛形感器，其中锥形感器对食物气味产生响应；毛形感器主要响应性信息素[2]。嗅觉感器主要位于触角上，少数分布于口器、下颚须、下唇须、翅、足及生殖器等部位。摘除不同部位的嗅觉感受器，对与家蚕的采食会产生不同的影响。崔为正等通过试验证明，家蚕摘除触角对高低不同食性的蚕影响基本相同，而摘除下颚须后，低食性蚕摄食性的提高幅度远大于高食性蚕。说明家蚕下颚瘤状体和下颚须的感觉机能的差异可能是造成不同高低食性的主要生理原因[3]。

家蚕嗅觉感受器是一种薄壁的表皮突起，与其神经系统联系在一起，从而对周围环境的各种气味信号做出反应，进而调节昆虫的各种行为。嗅觉感器表皮上有许多微孔，外界环境中的气味分子为脂溶性，可通过微孔进入感器淋巴液，与游离于淋巴液中的气味结合蛋白OBPs结合，形成气味-OBP复合体，复合体穿过淋巴液到达嗅觉受体神经元树突膜上，将嗅觉受体ORs激活，从而将气味分子携带的化学信号转化成电生理信号，然后通过轴突传到昆虫的中枢神经系统，最后经大脑的综合分析判断，指示昆虫做出相应的行为反应[4]。还有研究发现，昆虫感觉神经元膜蛋白及离子型受体(ionotropic receptors, IRs)也参与了昆虫嗅觉信号的转导过程[5]。

2 家蚕嗅觉相关蛋白

家蚕嗅觉反应的敏感性与高度选择性离不开嗅觉蛋白的参与调节，所以研究家蚕的嗅觉离不开对嗅觉相关蛋白的研究。一般来说，嗅觉蛋白分为三大类：气味结合蛋白(OBPs)、化学感受蛋白(CSPs)与气味降解酶(ODE)。其中OBPs主要包括两类：PBPs和GOBPs；CSPs中嗅觉蛋白包括三类：ORs、IRs和SNMP。

2.1 气味结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)

OBPs是一类小分子、水溶性酸性蛋白质，存在于昆虫的触觉淋巴感受器上，是昆虫识别外界气味物质的一个必需载体蛋白。OBPs一般含有120～150个氨基酸，10～30 kDa大小，具有ɑ螺旋结构、20个氨基酸左右的信号肽和六个半胱氨酸，可形成两个或三个二硫键，这些二硫键进一步折叠形成一个空腔，使OBPs可以与疏水配体结合[6]。同时由于OBPs位于外界环境与感觉神经元之间，因此形成了特定的气味结合特性，可通过分泌到嗅觉受体细胞周围的含水感器淋巴中与脂溶性气味分子发生作用，是昆虫识别外界气味信息的第一步，也是特异性识别的重要一步。

OBP对气味分子的运输和释放依赖于pH与α螺旋结构的改变，在高pH环境下，OBP结合气味分子并携带其穿过淋巴液，到达嗅觉神经元附近时，低pH环境使得OBPs C端的ɑ螺旋打开，携带的气味分子暴露并释放[7]。同时，OBP可以保护气味分子不被降解酶降解，以便顺利传输信号并激活气味受体。然而，一些研究表明，OBP并不是介导气味分子与ORs之间相互作用所必需的，气味分子可以直接刺激细胞中的几种受体[8]。

第一种昆虫OBP是通过与雌性性信息素结合而在雄蛾中鉴定的，被称为信息素结合蛋白(PBP)[9]。后通过免疫标记证明了PBP在雄蛾信息素感器中的定位[10]。之后，更多的OBP被发现，根据其蛋白质序列可分为四组：classical OBPs, Plus-C OBPs, Minus-C OBPs和Atypical OBPs。鳞翅目昆虫中OBPs通常分为两类，即性信息素结合蛋白PBPs和普通气味结合蛋白GOBPs。通过对6种昆虫中分离的14个昆虫OBPs的N端氨基酸序列分析表明，PBPs是可变的，而GOBPs是高度保守的。同时，PBPs与GOBPs虽然均可在同一个物种中表达，但GOBP的表达模式与PBPs明显不同。PBPs主要是雌性特有的，与信息素感觉神经元相关，而GOBPs存在于两性中，与一般气味的嗅觉神经元相关。龚达平等在家蚕中共鉴定出44个OBP基因，包括GOBP1、GOBP2、PBP1、PBP2、PBP3及其他38个OBP基因，它们分布于10个染色体上，形成6个亚家族[11]。

2.1.1 性信息素结合蛋白(Pheromone-binding proteins, PBPs)

PBPs在巨型蚕蛾天蚕触角感觉淋巴中首次被发现，约为16 kDa，可溶于水，在体内的浓度约为10 mM，并以同源二聚体的形式存在。人们认为性信息素分子需要与PBP相互作用才能激活OR和ORN。OR周围的感器淋巴液中PBP浓度极高，不同pH值可以引起PBP结构的构象变化，从而影响PBP与性信息素的结合与释放。家蚕中表达的高纯度PBP的NMR显示其三级结构会在pH值低于4.9时存在一种形式，而pH值大于6时转变为另一种 形式[12]。Ullah等证明PBPs在中性pH环境下比酸性环境下具有更强的配体亲和力，在OBP9的30个配体中，7个配体在pH值为7.4时结合更紧密，3个配体在pH值为5.0时更紧密[13]。同时利用整合到蛋白质中央核心的bombykol分子解析家蚕PBP1(BmorPBP1)的X射线晶体结构，以及超分子信息素PBP复合物激活OR和PBP-OR共表达的概念，都证明了PBP通过与性信息素分子和气味化学传感的相互作用进行调节的功能[14]。之后提出了许多基于PBP的性信息素失活和/或信息素在蛾触角中运输的动力学模型。

2.1.2 普通气味结合蛋白(general odorant binding protein, GOBPs)

根据氨基酸相似性，GOBP被分为两类：GOBP1和GOBP2。免疫细胞化学研究表明，GOBP1主要存在于毛形和锥形感器，而GOBP2多定位于雌性和雄性触角的锥形感器中[15]。GOBP2在对一般的气味分子敏感的感受器中表达，如植物挥发物。此外，虽然家蚕幼虫的GOBP2表达仅限于锥形感器、栓锥形感器或来自上颌触须和触角的其他味觉化学感受器，但GOBP2的成虫表达与雌蛾信息素腺有关，表明该蛋白具有多种功能[16]。GOBP2不仅在昆虫中表达，而且在细菌界也强调了参与各种额外的非嗅觉任务。Guo X等研究发现BmorPBP1和BmorGOBP2还具有结合维生素K1和多种不同维生素的能力[17]。

2.2 化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)

CSPs只有四个半胱氨酸和两个二硫键，比OBPs更小，更保守。CSPs用四个保守半胱氨酸以非互锁方式连接，产生两个小环，形成一个内部具有由6个α-螺旋围绕而成的疏水结合通道的球状结构，能够结合各种化学分子。Zhou等通过对基因组和表达序列标签(EST)数据库的分析，发现CSPs只存在于节肢动物门和两个亚门甲壳动物和单目动物中，并且首次在家蚕复眼中发现了六个CSPs以及在信息素腺中发现了一个非常高水平的家蚕CSPs[28]。

CSP在化学感受器淋巴中的定位以及与信息化学物质的结合表明，它们在某些方面可能与昆虫的化学感受有关。例如，Picimbon等在家蚕上发现两个化学感受蛋白(BmCSP1和BmCSP2)，经研究发现这两个CSPs可能与OBP有着相似的功能[19]。CSPs因此被认为在气味传导中的作用与OBPs相似，能够结合转运疏水性的配体或信息素。然而，没有直接证据表明CSPs在昆虫体内参与嗅觉反应。CSPs在一些非感受组织中也表达，同时有研究发现其在家蚕发育的不同阶段表达不同，说明CSPs可能具有其他非嗅觉的功能[20]。利用RT-PCR等技术鉴定发现CSPs基因不仅在触角中表达，在其他组织中也进行表达，包括腿部、唇瓣、跗骨、大脑、信息素腺和翅膀。与基本只在触角中表达的OBPs相比，CSPs在身体各部分的表达分布更广。根据其他学者研究推断，CSPs可能参与调节昆虫生长发育和蜕皮，以及腿部再生和细菌、病毒免疫相关作用。这种广泛存在的化学感受蛋白(CSPs)使得昆虫在进化过程中可以利用不同部位对于接收到的化学信息及时的做出相应的行为反应，使得昆虫更快更好的适应和接受复杂多变的环境与化学刺激。

2.2.1 气味受体蛋白(odorant receptors, ORs)

气味型受体(ORs)由味觉受体家族进化而来，与间接与离子通道相连的G蛋白偶联哺乳动物ORs相反，昆虫ORs主要作为离子受体发挥作用，由于受体激活和通道开放之间的直接联系，这可能使得昆虫的嗅觉感应相对敏感。ORs高度分化，无论是在物种内部还是在物种之间，ORs之间平均只有约20%的氨基酸同一性。

昆虫嗅觉受体(ORs)和味觉受体(GRs)最初因为与G蛋白偶联受体(GPCR)类似，也是七次跨膜蛋白，被归类为G蛋白偶联受体的一个大亚家族[21]。但随后有研究发现，昆虫ORs具有倒置的跨膜结构，在体外可以独立于异源三聚体G蛋白发出信号[22]。同时当OR蛋白质的N端位于细胞内，C端位于细胞外时，它们在膜内呈反向排列，表明其跨膜方向与GPCR相反。此外，OR蛋白与GPCR也没有序列相似性。虽然昆虫ORs不属于GPCR家族，但发现异源表达系统中的ORs功能通过其与G蛋白的相互作用来表征，适当的气味检测也依赖于G蛋白功能[23]。

昆虫的第一个ORs是由Hugh M. Robertson等从黑腹果蝇的基因序列中发现，之后ORs在膜翅目、鞘翅目、鳞翅目中逐渐被发现。2008年西南大学测定并公布了家蚕的完整基因序列，之后有学者利用家蚕的基因与已知的双翅目基因序列中的ORs比较，在家蚕中鉴定发现了6个ORs，被认定为性信息素受体。在Wanner等从家蚕基因组中鉴定的41个ORs中一些ORs基因可能在幼虫的感受器中特异性表达[24]。Sakurai等鉴定发现蛹后期和成虫期在雄性触角性信息感受神经元上可特异表达BmOR-1，是一种雄性特异G蛋白偶联编码家蚕醇受体的嗅觉受体基因[25]。有研究利用桑叶中的挥发性物质对家蚕部分ORs做了体外实验，研究发现OR19能够响应芳樟醇的刺激，OR45和OR47对于苯甲酸、2-苯乙醇以及苯甲醛的刺激产生响应，其中对于苯甲酸的刺激响应程度最大，对苯甲醛的刺激响应程度最小，未发现能使OR30产生响应的挥发性物质[26]。同年，Tanaka等人利用爪蟾卵母细胞进行细胞培养，将家蚕的7个ORs(BmOr-8,24,29,42,54,56,63)对于桑叶中不同的挥发性物质响应程度进行测定，发现了家蚕幼虫主要通过识别桑叶中的茉莉酮(cis-jasmone)来寻找并识别桑叶从而进食[27]。

嗅觉神经元上分布的嗅觉受体是一个异源复合物，由两部分组成：一个负责检测不同气味刺激的高度特异的OR，一个高度保守的非典型共表达的嗅觉受体Orco。OR/Orco复合体在每个神经元中表达，使单个神经元对气味的识别具有特异性。而在这个复合体中，Orco对OR的定位、稳定性及OR蛋白的正确折叠起重要作用，因此Orco对气味分子的感受不可或缺。Orco通过保守的胞内环与传统的OR相连，形成的异源二聚体构成配体门离子通道，共同接受气味分子的刺激。Orco在不同种类的昆虫中普遍表达，具有高度的保守性。一般将果蝇的Or83b、家蚕的Or2、伊蚊和按蚊的Or7统一命名为Orco。Nakagawa等采用定点突变的方法证明OR-Orco复合物的离子通道活性与保守的氨基酸残基Glu、Asp和Tyr密切相关[28]。

21世纪初，Krieger等利用同源基因克隆了家蚕Orco基因，发现家蚕Orco基因共编码472个氨基酸，与其他物种同源基因氨基酸序列的相似性高达65%～87%[29]。通过原位杂交及RT-PCR发现Orco基因在家蚕的化学感受器官中广泛表达，并能够定位到嗅觉神经元细胞中[22]，但在蛋白水平的研究还未见报道。Orco的功能在家蚕和其他物种中是比较一致的，Orco一般与其它嗅觉受体结合，形成复合体OR-Orco在生物体内作用。Nakagawa等利用爪蟾卵母细胞表达系统表达BmOR1-BmOrco复合体，结果表明Orco作为陪伴受体确保BmOR1发挥作用感受性信息素Bombykol[28]。

通过抗体染色发现，Orco蛋白主要在家蚕幼虫触角第二环节及第三环节的锥形感器有表达，在家蚕幼虫下颚瘤状体的锥形感器及下颚须前端也均检测到了Orco的表达。首次从蛋白水平研究了家蚕Orco的蛋白定位，为家蚕Orco蛋白的功能研究奠定了基础。之后利用qPCR及免疫荧光检测，结果表明Orco在mRNA及蛋白水平的表达量与家蚕对人工饲料摄食性的高低呈负相关，即对人工饲料摄食性好的品种Orco的表达量低。反之，摄食性差的品种Orco的表达量高。推测可能由于嗅觉受体Orco对昆虫的嗅觉识别起着关键性作用，其表达量低，可能会影响昆虫嗅觉的敏感性。Orco在对人工饲料摄食性好的家蚕品种中的表达量低，可能使得家蚕的嗅觉不敏感，对人工饲料中挥发性的抑食因子不敏感，因而对人工饲料的摄食性较好。反之，Orco表达量高的家蚕品种，其嗅觉敏感，对人工饲料中的抑食因子敏感，因而不喜欢取食或不取食人工饲料。

2.2.2 离子型受体(ionotropic receptors, IRs)

鳞翅目的IR蛋白可分为3个亚科，分别为触角IRs (A-IRs)、鳞翅目特异性IRs (LS-IRs)和D-IRs。在这3个亚家族中，同源群中的A-IRs和LS-IRs成员表现出高度的基因结构保守性，而D-IRs成员的氨基酸同源性极低(低于30%)。

IRs与昆虫气味受体(ORs)无关，是由一个保守的突触配体门控离子通道家族—离子型谷氨酸受体(IgLUR)进化而来，并基于配体的离子通道发挥作用。与ORs对醇和酯的广泛调节不同，IRs对于酸和胺的调节范围很窄。IRs与iGluRs的同源性有助于剖析这些嗅觉受体定位于OSN感觉纤毛、识别气味和产生神经元去极化的机制[30]。与IgLUR一样，IRs包含一个细胞外N-末端、一个二分配体结合域(LBD)，其两个叶(S1和S2)由一个离子通道域分隔，以及一个短的细胞质C-末端区域。尽管IRs结构域组织与iGluRs相似，但两者同源性较低(<34%氨基酸序列同一性)。

IRs对于气味诱发的神经元反应是必要和充分的。例如，ac4苯乙酸/苯乙醛受体IR84a或球囊受体IR64a的突变选择性地消除了相应神经元中的嗅觉反应；IR84a在OR22a神经元(在基锥感受器中)或爪蟾卵母细胞中的表达，仅当与IR8a共表达时，才足以产生对苯乙醛的反应[31]。

2.2.3 嗅觉特异性膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)

SNMP是最初在鳞翅目昆虫信息素敏感的OSN中发现的昆虫特异性膜蛋白，对于检测信息素是必不可少的。基于SNMP在信息素敏感的OSN中的表达及其与CD36家族蛋白的关系，有学者对SNMP的几种可能作用进行了推测，包括亲脂性化合物的跨膜转运功能、OBP/信息素复合物与膜的对接功能、作为共同受体介导信息素向气味受体的转移[32]。

鳞翅目昆虫的SNMPs通常可分为两个亚族：SNMP1和SNMP2。两个亚族高度分化，氨基酸序列相似性仅为30%，表明这些SNMP在体内具有不用的功能。SNMP1主要在性信息素敏感的毛形感器中表达，表达于信息素感觉神经元的树突膜上，是果蝇脂肪酸衍生信息素11-顺式醋酸乙烯酯(cVa)检测的关键辅助因子，但对一般气味则不需要，表明其可能与性信息素识别有关[33]。SNMP2不仅在雌雄虫的毛形感器中表达，在雄虫的刺形感器中也有与其相关的感器。然而，与SNMP1相比，SNMP2通常在昆虫体内分布更加广泛，在化学感受器口器、腿、翅膀、胸部、腹部和中肠等都有所表达。这种广泛的表达模式表明，SNMP2s除了参与嗅觉过程外，还可能在昆虫身体的组织中发挥非嗅觉功能。但SNMP2仅在支持细胞中表达。

后来有学者发现了新的SNMP，基于它们与蛾类SNMP类型的系统发育关系，将其命名为SNMP3。但是SNMP3转录本仅在家蚕和棉铃虫的成虫和幼虫肠道中检测到，并未有证据证明其参与嗅觉反应，并且这种蛋白质在消化系统中的具体作用也尚不清楚[34]。

2.3 气味降解酶(odor degrading enzymes, ODE)

在OR激活后，嗅觉信号必须迅速降解以防止长时间的嗅觉神经元兴奋，ODE便是用来降解气味分子以恢复昆虫嗅觉系统的灵敏度。ODE存在于昆虫的触角感觉淋巴中，包括羧酸酯酶(CEX)、醛氧化酶(AOX)、乙醇脱氢酶(AD)、细胞色素P450(CYP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和触角酯酶(AE)等。

第一个昆虫ODE是从雄性天蚕触角中鉴定出的触角特异性酯酶(ApolSE)，其特征是可在体内和体外快速降解性信息素[35]。通过RT-PCR与RT-qPCR试验鉴定ODE，发现了一些具有组织偏向性表达的ODE，例如，在稻纵卷叶螟中鉴定出的18个羧酸酯酶(CXE)基因，以及埃及角叉线虫的SICXE17的编码基因在雄性中的表达量是雌性的3倍[36]。将未交配的雄蛾暴露于雌蛾的性信息素挥发范围内，GmolCXE1和GmolCXE5的转录表达水平显著增加。这些酶在雄性中的大量表达，表明ODE参与了性信息素的的浓度调节，因为大多数种类的蛾类中，正是雌性产生并释放这些信息化学物质来吸引同种配偶。同时，当幼虫接触新鲜成熟的食物时，头部富集的基因GmolCXE13、GmolCXE14和GmolCXE21显著上调，表明ODE同时也参与了食物气味的降解。

3 家蚕嗅觉相关蛋白的研究展望

嗅觉是昆虫行为的基础。鳞翅目昆虫作为研究昆虫嗅觉蛋白的模型，而家蚕是鳞翅目中的寡食性昆虫，其嗅觉机理的发现对于研究其他昆虫的嗅觉系统具有一定的参考意义。

通过研究家蚕气味结合蛋白、化学感受蛋白和气味降解酶三大方面，阐明家蚕对环境中挥发物质的识别机制和基本原理，一方面能揭示家蚕觅食、交配、繁殖等生物学机理，有助于阐明嗅觉调控昆虫行为的本质原因；另一方面对于改变家蚕的食性、提高家蚕饲喂效率或探索其他生物防治害虫的新策略可以提供新的思路。近年来，人们利用自主筛选保留了广食性品种家蚕GS01，研究发现其 BmOr39 与 BmOrJ 基因在化学感受器中的低表达使得GS01对普通颗粒人工饲料(桑叶粉添加含量低)的适应性较好，具有良好的人工饲料饲养的实用化潜力[37]。还有研究利用CRISPR/Cas9系统建立了具有截断味觉受体66(GR66)蛋白的纯合突变家蚕品系，突变家蚕品系的苦味觉受体(GR)缺少GR66的编码，对除桑叶外的植物表现出较好的取食行为[38]。利用基因编辑技术编辑或剪切影响昆虫的基因片段，建立广食性突变家蚕品系，或者利用人工饲料和非桑植物对非广食性家蚕进行广食性品系的挑选培育，对人工饲料在生产中的应用和实现家蚕商品化生产具有重要意义，同时有助于对家蚕食性的进一步研究。

家蚕嗅觉机制分子水平研究不断深入，更多昆虫的嗅觉相关蛋白被发现和鉴定，但还不足以系统全面地认识和了解昆虫的嗅觉系统。比如Orco基因不仅在嗅觉器官中表达，同时在胸部、腹部、生殖器、肠道等部位表达，Orco的功能还需要更深一步的研究；家蚕相比于野蚕更高的CSPs基因表达量在哪些方面发挥重要作用还有待解答；SNMP3作为嗅觉特异性膜蛋白却并未有证据证明其参与嗅觉反应，而在幼虫中肠中特异性表达，并参与了蚕对病毒和细菌感染的免疫反应。

随着生物技术的发展，分子生物学与基因组学、蛋白质组学、代谢组学以及生物信息学的紧密结合，家蚕嗅觉机制将会被更好的了解，这对于广食性家蚕的选育与工厂化养蚕也将起到重大促进作用。