基于网络药理学的金银花-连翘药对干预银屑病的分子机制*

曹一钦，文昌晖，△，王秀琳，张玲丽，贾敏，李斌

1贵州中医药大学，贵州 贵阳 550001；2贵州中医药大学第一附属医院皮肤科；3上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院

银屑病是一种遗传与环境共同作用诱发的免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病［1］，其发病机制主要与遗传、环境及机体免疫等因素相关；典型临床表现为鳞屑性红斑或斑块，局限或广泛分布，无传染性，治疗困难，常终身带病；主要病理表现为以T淋巴细胞介导为主的多种免疫细胞共同参与的免疫反应引起角质形成细胞过度增殖或关节滑膜细胞与软骨细胞发生炎症。

消疕汤是贵州省名中医贾敏教授经验方，在临床运用30来年，用于治疗寻常型银屑病进行期中医辨证属血热风燥证者。金银花、连翘二药均为消疕汤的君药，现代药理研究认为金银花、连翘均有抗炎、抑菌、调节免疫等作用［2-3］。现结合网络药理学原理探究金银花-连翘药对干预银屑病的分子通路及作用机制。

1 中药网络药理学思路

基于网络药理学研究方法，应用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)等［4］，构建关于金银花-连翘药对干预银屑病作用机制的“中药-成分-靶标-通路”网络，为进一步研究银屑病发病机制及中医药治疗提供思路。

1.1 数据来源与方法

1.1.1 金银花-连翘化学成分和潜在作用靶标收集依据《中华人民共和国药典》（2015年版），通过TCMSP平台（http：//tcmspw.com/tcmsp.php，中国药科大学）在中药信息设定界面对“金银花”“连翘”进行检索并收集其所有化学成分，同时按照筛选标准［5］口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30.0%和药物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18选取有效成分，建立金银花-连翘化学成分信息数据库。通过TCMSP平台Related Targets信息数据检索界面，分别收集金银花-连翘潜在作用靶标，建立金银花-连翘活性成分与潜在作用靶标的联系网络。

1.1.2 银屑病靶标收集通过GeneCards平台（https：//www.genecards.org），以银屑病的英文名称“Psoriasis”为关键词进行检索，收集到疾病靶标数据库中目前已知的银屑病治疗靶点作为金银花-连翘药对的候选治疗靶标，靶标信息主要包括治疗银屑病药物的名称、疗效、临床应用、作用靶标的基因及蛋白质等相关信息。

1.1.3 蛋白质-蛋白质相互作用信息（PPI）通过TCMSP整合了String平台（https：//string-db.org/cgi/input.pl）等数据库中蛋白质-蛋白质相互作用信息。以置信度得分大于0.4为筛选参数分析金银花-连翘药对干预银屑病靶点之间的相互作用关系，运用Cytoscape软件构建PPI，并通过Network Analyzer工具分析网络中节点的度值，根据度值的排序确定核心靶点。

1.1.4 网络构建与分析通过网络综合分析，构建药对潜在靶标与疾病靶标之间的PPI信息网络特征值，运用Cytoscape软件的MCODE插件筛选蛋白互作网络中的蛋白模块，筛选关键蛋白模块。取中药靶标-疾病靶标互作网络的核心节点，以度值=2、节点=2和最大深度=100作为筛选参数，选取药对潜在靶标-疾病靶标相互作用网络的关键节点［6］。通过基因本体论功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路，挖掘分析金银花-连翘药对干预疾病关键靶标及其对应的活性成分，并构建“中药-核心成分-关键靶标-主要通路”的网络通路图，进一步明确金银花-连翘药对干预银屑病的主要分子作用机制。

1.1.5 关键靶标分析及通路富集结合TCMSP和String数据库信息，整合GO（http：//www.gene ontology.org）和KEGG（http：//www.kegg.jp）资源，直接提取靶标基因或蛋白质分子功能、细胞内定位及其所参与的生物学反应和通路，运用R软件处理相关数据，将金银花-连翘药对干预银屑病的关键作用靶标进行基因功能和通路富集分析，以P值降序的方式将GO和KEGG计算分析的结果排列显示，并应用R软件绘制GO和KEGG富集分析气泡图。

2 结果

2.1 金银花-连翘药对化学成分靶标预测及分析通过TCMSP数据库共收集得到金银花活性成分236个，主要为有机酸类、黄酮类、环烯醚萜苷类、三萜皂苷类、挥发油类；连翘化合物150个，主要为苯乙醇苷类、木脂素类、萜类、黄酮类及挥发油类、生物碱类。按OB≥30.0%和DL≥0.18标准筛选后，金银花-连翘药对化合物与银屑病相关的成分共28个，金银花成分15个，连翘成分17个，两药相同成分4个：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、β-谷固醇（beta-sitosterol），药对度值≥20个共6个，占21.43%。由此可见，“金银花-连翘”中的候选化合物分子可能多靶标、多途径作用于整个生物网络系统，提示金银花和连翘在共性靶标之间存在明显潜在加成作用。见表1。

表1 “金银花-连翘”药对干预银屑病的28个活性成分

对“金银花-连翘”药对活性成分通过TCMSP平台进行作用分析，取Degree排名前20，得到候选靶标具有的基因功能信息涉及：前列腺素G/H合酶1和2、半胱胺酸天冬氨酸酶（Caspase）-3和9、胰蛋白酶-1、间质胶原酶、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、谷胱甘肽S-转移酶Mu2，核受体辅激活剂、细胞凋亡调节剂，钠通道蛋白型5亚基α，β-2肾上腺素能受体、聚乙二醇肾上腺素能受体、雌激素受体、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、雄激素受体，钾电压门控通道亚科H成员，γ-氨基丁酸受体亚基α-1、转录因子AP-1、细胞凋亡调节因子等。

2.2 “金银花-连翘”药对治疗银屑病的核心靶标网络共获得银屑病相关差异基因3601个，药对共同作用靶点127个，其中金银花115个，连翘121个，两药相同的靶标112个。

通过TCMSP的PPI相互作用数据库，构建“金银花-连翘”药对的潜在靶标与疾病靶标相互作用网络，取排名前30，得到候选靶标基因，Akt1、ALB、IL6、VEGFA等靶标排名靠前。基因功能信息涉及：雌激素受体(estrogen receptor，ESR)、核激素受体、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受体、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)受体，调节T细胞、B细胞、内皮细胞，抑制活化巨噬细胞、辅助T细胞的产生，调节新陈代谢、血管生成、脂肪分解，促炎细胞因子、炎细胞因子，调节苏氨酸激酶、酪氨酸蛋白激酶、受体酪氨酸激酶活性，调节细胞外刺激引起的细胞级联反应，EGF受本信号通路、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGFβ)介导的信号转导通路、SAP/JNK信号通路、胸腺-磷酸（MAP）激酶信号转导通路、核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路等。由此可知银屑病的发病机制涉及多个病理环节的不同分子作用过程。见图1。

图1 “金银花-连翘”药对的潜在靶标（前30名）

2.3 金银花-连翘药对干预银屑病关键靶标的GO基因功能分析通过GO功能分析“金银花-连翘”药物靶标与疾病靶标基因功能，获得138个条目，具有显著意义的有127个条目（P＜0.01），采用P值降序和基因富集数量综合过滤，对其进行排序，前20名的生物学功能主要涉及：核受体的活性、转录因子活性、细胞因子受体结合、细胞因子活性、类固醇激素受体活性、受体配体活性、泛素样蛋白连接酶结合、磷酸酶整合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、氧化还原酶活性、血红素结合、蛋白磷酸酶整合、四吡咯整合、激素受体结合、核激素受体结合、泛素蛋白连接酶结合、激活转录因子结合、激酶调节活性、整合蛋白结合、BH功能点位整合，见表2、图2。

图2 “金银花-连翘”药对候选靶标具有的功能信息气泡图（前20名）

表2 “金银花-连翘”药对候选靶标具有的功能信息

2.4 “金银花-连翘”药对治疗银屑病KEGG的通路富集分析KEGG通路富集分析共获得155条通路，具有显著意义的有145条通路（P＜0.01），采用P值降序和基因富集数量综合过滤，前20名干预银屑病的主要作用通路涉及：糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、白细胞介素17(interleukin-17，IL-17)信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、前列腺癌、乙型肝炎、人巨细胞病毒感染、丙型肝炎、膀胱癌、蛋白多糖在癌症中的作用、南美锥虫病（美洲锥虫病）、胰腺癌、C型凝集素受体信号通路、小细胞肺癌、内分泌抗性、结肠直肠癌、甲型流感、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路、麻疹，其中PI3K-Akt信号通路的度值最高（Degree=31）。见图3—4、表3。

表3 “金银花-连翘”药对候选靶标参与的通路信息

图3 “金银花-连翘”药对候选靶标参与的通路信息气泡图（前20名）

图4 “金银花-连翘”药对干预银屑病关键靶标通路信息

3 讨论

消疕汤有清热疏风、凉血止痒功效。研究发现：消疕汤可以降低银屑病患者血清中促炎细胞因子水平（如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-17、IL-22、IL-23等），升高抑炎因子（TGF-β1、SOD、IL-10等）水平，升高血清Treg细胞比例，使得Th17/Treg水平趋于平衡，以调节免疫状态、控制炎症反应［7-10］。动物实验研究发现，消疕汤可以抑制银屑病模型组大鼠皮肤角质细胞的角化不全及角化过度，并减少炎症细胞在皮损部位的浸润［11］。银屑病属中医学“白疕”范畴，多因素体营血亏虚，血热内蕴，化燥生风，肌肤失养而成。李斌教授［12-13］认为寻常型银屑病的病机为血热阳浮，以热为主，病位在血分，血热是根本病机，宜“从血论治”，并使用辛散宣发或轻清宣透之品，使伏藏的邪气或由表或由上而解，或由里达外而解。金银花、连翘二药为消疕汤中的君药，性味轻扬宣散，有清热凉血、发散宣透功效。现代药理研究认为：金银花、连翘有抗炎、抑菌、调节免疫作用［2-3］。金银花-连翘药对度值最高的化学成分是槲皮素、木犀草素，均为黄酮类。现代药理研究认为槲皮素是一种黄酮类抗氧化剂，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降糖及免疫调节等作用［14］，可减少（IL-1β、IL-6、MCP-1、IP-10、G-CSF、TNF-α和VEGF）等促炎细胞因子的产生［15］，增加抗炎细胞因子（IL-4、IL-10和TGF-β1等）水平［16］，还可以抑制TGF-β1过度表达［17］，从而发挥抗炎作用。WILLIAMS等［18］研究发现：槲皮素是广泛的激酶抑制剂，可作用于PI3K-Akt通路，调节酪氨酸激酶、蛋白激酶C（PKC）和丝裂原活化蛋白激酶水平。木犀草素有消炎、抗过敏、降尿酸、抗菌、抗病毒等作用［3］。

目前认为银屑病的发生发展与T辅助细胞（Th）、树突状细胞（DC）、巨噬细胞（MC）、角质形成细胞（KC）及其分泌的细胞因子之间复杂的相互作用密切相关。乔菊等［19］认为TNF-α信号通路、IL-17通路在银屑病发病机制中有重要作用。丁琦等［20］发现银屑病患者血清Th17和IL-17水平上升，Treg表达下降，进一步证实了Th17/Treg失衡是银屑病发病的关键因素。银屑病的重要病理改变是皮损区微循环异常及血管内皮功能受损，予改善血管内皮功能及调节微循环的药物治疗后可缓解病情［21-22］。角质形成细胞过速增殖也是其病理特征之一，其机制尚不清楚。张淼等［23］认为：PI3K-Akt信号转导通路对研究银屑发病机制有一定指导作用。

PI3K-Akt信号通路：目前研究表明PI3K-Akt信号转导通路是细胞存活的重要通路，参与细胞生长、细胞增殖、血管新生、细胞能量代谢和肿瘤细胞侵袭等多个过程，在细胞生长、增殖等功能中起重要作用［24］，Akt是PI3K的下游靶蛋白，也是PI3K信号通路的关键分子，通过磷酸化其下游FoxO、mTOR等蛋白来调控细胞增殖与凋亡。国内外研究表明，银屑病的发生涉及一个未知的环境因素，它作用于遗传易感性宿主，从而触发炎性和免疫性级联反应［25-27］。应激化角质细胞释放出一系列因子激活真皮层树突细胞，后者随后进入淋巴结释放出IL-12和IL-23，促进T细胞分化为Th1和Th17细胞，并通过趋化因子和黏附分子转移至真皮层和表皮层，之后激活的T细胞在真皮层激活巨噬细胞并释放出众多的炎性细胞因子（包括TNF-α、IFN-γ和IL-17），继而导致角质形成细胞的活化和增殖，临床表现为银屑病斑块。Akt是PI3K信号通路下游直接的靶蛋白，Akt活性增强可引起角质细胞的过度增殖和真皮乳头血管增生［28］。

IL-17信号通路：在外界刺激下DC过度分泌TNF-α和IL-23（包括IL-12），IL-23诱导幼稚T淋巴细胞分化为Th17细胞，Th17细胞产生的IL-17和IL-22水平升高。Treg细胞与Th17细胞是一种CD4+T淋巴细胞亚群在不同条件下分化生成，分别介导免疫耐受与炎症反应，两者在功能上相互拮抗。在银屑病起始阶段，未知的环境刺激或耐受性丧失（例如自身抗原活化）导致TNF的产生和随后皮肤树突细胞的活化，来自皮肤树突细胞的细胞因子IL-23大量增加，随后刺激Th17细胞、CD4+辅助性T细胞、细胞毒性CD8+T细胞数量增加，产生大量IL-17、IL-22和TNF-α［29］，导致促炎细胞因子的产生，包括IL-1β、IL-6和TNF-α以及表皮角质细胞的依赖性增殖。IL-17与其相应受体结合后激活下游p38MAPK信号通路［30］，继而上调IL-6表达，直接刺激银屑病患者表皮增生［31］；IL-17可上调IKKα/β磷酸化，通过NF-κB信号通路调节趋化因子、细胞因子（IL-6、TNF-α、COX-2），导致中性粒细胞募集移行并聚集于银屑病皮损之中，IL-17还可诱导生成VEGF，从而诱发或加重银屑病皮损。Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17、IL-6、IFN-γ水平升高，抑制性Treg细胞数量减少，分泌的抑制性细胞因子IL-10含量减低，可诱发皮损区炎症细胞及T淋巴细胞聚集浸润、增生，致使银屑病久治不愈［29-32］。

TNF信号通路：TNF-α是一种重要的促炎症性细胞因子，具有促进多种细胞因子产生和调节免疫反应信号网络的作用，可引起机体强烈的炎症反应［33］。TNF-α可直接促进皮肤角质形成细胞增生［34］。TNF-α能通过激活银屑病相关基因与IL-17协同活化角质形成细胞，募集嗜中性粒细胞等炎症细胞浸润，诱导产生抗菌肽，过度分泌的TNF-α反作用于DC刺激异常免疫反应持续进行［35］，TNF-α可通过诱导T细胞来表达VEGF，促进银屑病患者真皮乳头层毛细血管的扩张和扭曲，以及斑块的形成［36］。TNF-α参与全身过敏反应，增加血管内皮细胞的黏附分子表达［37］，从而促进血管增生，加重银屑病皮损。

综上所述，应用网络药理学方法对金银花-连翘药对干预银屑病的活性成分、关键靶点和分子通路机制进行了初步预测，为进一步研究消疕汤干预银屑病提供了思路。由于数据库数据不全，且忽略了中药成分含量、相互作用以及体内其他药代动力学影响等，具体机制有待临床或动物实验的进一步研究，因此本研究尚有一定局限性。