堪萨斯分枝杆菌鉴定及耐药机制研究进展

任汝颜 于霞 黄海荣

首都医科大学附属北京胸科医院（北京 101149）

非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）是指除结核分枝杆菌复合群（mycobacterium tuberculosis complex，MTC）和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌的统称。近年来，NTM 病的发病率和死亡率在世界范围内均呈上升趋势，其中，堪萨斯分枝杆菌（mycobacterium kansasii，M.kansasii）是临床常被分离到的NTM 菌种之一。堪萨斯分枝杆菌感染后的临床表现与结核病不易区分，且对常用药物的耐药日趋严重，给临床治疗带来了巨大挑战。本文就堪萨斯分枝杆菌的鉴定技术、主要治疗方案及多种药物的耐药机制予以综述。

1 堪萨斯分枝杆菌的亚型组成

堪萨斯分枝杆菌属于慢生长分枝杆菌，适宜生长温度范围为32℃～42℃。由于细胞壁疏水性的差异，分离菌株的菌落可呈现平坦或凸起、光滑或粗糙等不同的形态，有时可呈颗粒状［1］。堪萨斯分枝杆菌属光产色菌，抗酸染色阳性，对硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼生长试验、过氧化氢酶、硝酸盐还原试验、吐温-80 水解试验和尿素水解试验均为阳性。基于以上生长特征和生化特性的生化实验为主的鉴定技术由于操作复杂、耗时且结果不准确，现已基本被弃用，仅对硝基苯甲酸选择性培养基法仍用于NTM 的初步鉴定。

目前，同源序列比对法是分枝杆菌菌种鉴定的主要方法。临床常用的分枝杆菌菌种鉴定标识主要包括16S rRNA 编码序列，16S-23S rDNA 转录间隔区（internal transcribed spacers，ITS），RNA 聚合酶的β 亚基（β-subunit of RNA polymerase，rpoB）和热休克蛋白65（65-kDa heat shock protein，hsp65）编码基因。其中，16S rRNA 编码序列无法区分堪萨斯分枝杆菌和与其同属于堪萨斯分枝杆菌复合群的胃分枝杆菌，不能单独应用于堪萨斯分枝杆菌的鉴定［2］。ITS 序列依菌种不同其碱基排列顺序及长度变异较大，含数个高度可变的菌种特异序列，其多态性高于16S rRNA 编码序列，能将堪萨斯分枝杆菌与胃分枝杆菌相鉴别［3］。随着分子流行病学技术的发展，hsp65PCR-REA（restriction enzyme analysis）技术进一步将堪萨斯分枝杆菌分成7 个亚型（Ⅰ-Ⅶ型），其中亚型Ⅰ是引起人类疾病的最常见亚型，Ⅱ型较多出现在人类免疫缺陷病毒感染的患者中，其余5 个亚型则通常从环境中分离获得［4］。最近，基于全基因组平均核苷酸同一性（genome-wide average nucleotide identity，gANI）可以更精确地将堪萨斯分枝杆菌分成六个亚型，分别是M.kansasii（前亚型Ⅰ），M.persicum（Ⅱ），M.pseudokansasii（Ⅲ），M.ostraviense（Ⅳ），M.innocens（Ⅴ），M.attenuatum（Ⅵ）。大多数与疾病相关的菌株属于Ⅰ型，而其他分型的菌株常与环境来源有关［5-6］。此外，BAKUŁA 等［7］人基于编码热不稳定延伸因子（thermo-unstable elongation factor，EF-Tu）的tuf基因序列分析，开发了一种快速的堪萨斯分枝杆菌亚型分型新方法。该研究纳入15 株标准菌株和80 株临床分离株，以hsp65、rpoB和ITS 测序结果作为对照，单用tuf鉴定堪萨斯分枝杆菌与对照方法的一致性为100%。由于tuf在堪萨斯分枝杆菌临床分离株中的序列相似性范围为93%～98%，tuf可进一步将堪萨斯分枝杆菌分成六个亚型，不同型之间核苷酸差异从14 个（亚型Ⅱ和亚型Ⅳ）到46 个（亚型Ⅲ和亚型Ⅵ）不等。在不同的堪萨斯分枝杆菌亚型中，大多数感染是由亚型Ⅰ所致，人类免疫缺陷病毒感染的患者常见亚型Ⅱ，其他亚型通常不致病，均从环境中获得［8］。不同亚型对不同治疗药物的敏感性存在差异。在BAKUŁA 等［9］的研究中，亚型Ⅰ菌株和亚型Ⅱ菌株对不同药物的最低抑菌浓度（minimal inhibition concentration，MIC）、MIC50和MIC90存在明显差异。上述结果表明，对堪萨斯分枝杆菌的鉴定并精确分型到亚型有十分重要的临床用药指导意义，不仅有助于流行病学研究，同时也为疾病治疗选药方案的制定提供重要参考。

2 治疗堪萨斯分枝杆病的标准化疗方案

美国胸科学会/美国感染性疾病学会指南推荐的抗堪萨斯分枝杆菌的一线治疗方案包括异烟肼（isoniazid，INH）、利福平（rifampin，RIF）和乙胺丁醇（thambutol，EMB）等三种一线抗结核药物，疗程为18 个月或培养转阴后12 个月［4］。堪萨斯分枝杆菌是唯一一个相关疾病以一线抗结核药物治疗为主的NTM。从获得的数据来看，含有RIF 的方案疗效好，治疗失败率极低（1.1%），长期复发率低（＜1%）［1］。临床实验室标准化研究所（CLSI）指南建议：对未经治疗的堪萨斯分枝杆菌，仅需进行RIF 药敏试验，对于RIF 耐药株，需进行以下药物敏感性检测：INH、阿米卡星（amikacin，AMK）、链霉素（streptomycin，STR）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、莫西沙星（moxifloxacin，MXF）、克拉霉素（clarithromycin，CLR）、利福布汀（rifabutin，RFB）和磺胺甲恶唑（cotrimoxazole，SXT）。对于存在RIF耐药的堪萨斯分枝杆菌病，目前推荐使用大环内酯类［CLR 或阿奇霉素（azithromycin，AZI）］、氟喹诺酮类（fluoroquinoones，FQ）、SXT 或STR 三药联合治疗方案［4］。该方案排除INH 和EMB 是因为有研究表明INH 或EMB 的耐药株通常也出现RIF耐药［10］。

3 常用抗堪萨斯分枝杆菌药物的耐药机制研究

堪萨斯分枝杆菌病在常见的NTM 病中属于治愈率最高的一种，然而越来越多耐药的堪萨斯分枝杆菌的分离鉴定提示需要关注其耐药的问题。虽然堪萨斯分枝杆菌对不同药物的耐药机制与结核分枝杆菌的耐药机制类似，但由于不同菌种同源序列的差异，也展现出一些菌种特异性的特点。

3.1 异烟肼INH 作为一种前药进入MTB 后首先被过氧化氢-过氧化物酶（catalase—peroxidase，katG）还原成能够结合NAD/NADH 的异烟肼酰基自由基，结合生成的INH-NAD 加合物抑制烯酰基载体蛋白InhA 形成，从而阻断细胞壁分枝菌酸的合成而发挥杀菌作用［11］。自20世纪50年代以来，INH 已作为一线药物用于结核病治疗和预防，而堪萨斯分枝杆菌对INH 的MIC 比结核分枝杆菌的MIC（MIC ≤0.02 μg/mL）高出100 多倍，但依然低于INH 最高血药浓度，这也是INH 可作为堪萨斯分枝杆菌一线治疗药物的主要原因［12］。为阐明不同分枝杆菌对INH 敏感性差异的原因，REINGEWERTZ 等［13］将对INH 敏感的牛分枝杆菌的katG（记做KatGbov）分别转入海分枝杆菌（M.marinum；记做M.marinumKatG-bov）和鸟副结核分枝杆菌（Mycobacterium aviumsubsp.paratuberculosis，MAP；记做MAPKaG-bov），分别对照其野生株（M.marinumcherry 和WT.MAP），显示其对INH 的敏感性均提高了20～30 倍。为了排除katG高表达的作用，随后又克隆了海分枝杆菌的katG蛋白（KatGmar）转入其野生株，使katG高表达，此时菌株对INH 的敏感性升高不显著。上述研究表明使分枝杆菌对INH 敏感的原因并非katG蛋白高表达，而是牛分枝杆菌中katG蛋白的作用。通过对不同分枝杆菌的katG进行序列比对，发现katG在非结核分枝杆菌间高度保守，而与结核分枝杆菌差别较大。同时，等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry，ITC）显示KatGbov与INH 的结合能力要高于KatGavp，而KatGmar不能与INH 结合。酶活性分析表明只有KatGbov能够实质性地催化INH-NAD 加合物的形成。由于该研究所涉及分枝杆菌种类较少，有必要纳入更多的对INH 不同敏感性的分枝杆菌进行研究，如将INH 作为一线用药的堪萨斯分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌，以及对INH 敏感的结核分枝杆菌，对比并进行更全面深入的研究。

关于在堪萨斯分枝杆菌中INH 耐药与基因突变也有零星报道。KHOSRAVI 等［14］发现INH 耐药的堪萨斯分枝杆菌中，katG的突变率为67.7%～95%。然而ZOFIA BAKUŁA等［9］选择了对INH 敏感性存在差异的堪萨斯分枝杆菌菌株，包括5 株MIC=1 μg/mL 和5 株MIC=4 μg/mL 的菌株，通过序列比较发现所有的10 个分离株具有相同的inhA和katG序列，并未发现INH 耐药与inhA和katG突变相关。因此，在堪萨斯分枝杆菌中INH 耐药是否与inhA和katG突变村上相关性尚未有定论，是否存在其他耐药机制也还属未知，有待更多研究加以证实。

3.2 利福平利福霉素（如RFB，RIF 等）通过抑制细菌的RNA 合成启动发挥作用，主要作用机制是通过与原核生物的DNA 依赖性RNA 聚合酶结合，抑制该酶的活性发挥抗菌作用。RNA 聚合酶的催化中心β亚基是利福霉素的结合位点。其编码基因rpoB突变与利福霉素耐药相关。KLEIN 等［15］在6 株RIF 耐药的堪萨斯分枝杆菌中发现rpoB基因序列均发生突变。其中，4株检测到S531L 突变，这也是对RIF 耐药的MTB 和麻风分枝杆菌最常见的突变形式；1 株出现Q513L 突变，1 株为H526Y突变。YOSHIDA 等［16］对314 株堪萨斯分枝杆菌的rpoB基因序列分析，发现3 株RIF 耐药菌株的rpoB基因513 和516 位密码子上突变。由此可见，堪萨斯分枝杆菌对RIF 耐药主要是由rpoB突变造成，对堪萨斯分枝杆菌进行基于rpoB的分子诊断可以快速检测其对RIF 敏感性，有利于临床制定合理的化疗方案。

3.3 乙胺丁醇EMB 是一个抑菌药，对于生长繁殖期的结核分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌均有较好的抑菌效果，对静止期的细菌几乎无作用，且在中性pH值中的作用最强。EMB对分枝杆菌的直接作用是破坏细胞壁合成，特别是抑制阿拉伯半乳聚糖合成，并且在一定程度上抑制阿拉伯甘露聚糖合成。embB基因编码阿拉伯糖基转移酶是细胞壁合成的关键，该基因突变会导致大部分堪萨斯分枝杆菌对EMB 产生获得性耐药［17］。QUAN［18］检测了85 株堪萨斯分枝杆菌对EMB 的敏感性，耐药率高达97.6%，即使非耐药菌株的MIC 也处于耐药临界值附近，所有检测菌株embB都存在Met306Ile、Gly406Pro 和Pro423Ie，提示该基因突变可能与其对EMB 敏感度下降有关。

3.4 大环内酯类大环内酯类抗菌药物通过与细菌核糖体的23S rRNA 结合，抑制转肽、移位和肽链延长，并最终抑制细菌蛋白质合成而发挥抗菌作用［19］。BAKUŁA 等［9］的研究中，85 株堪萨斯分枝杆菌临床分离株对CLR 耐药率为1.2%（1/85），唯一的耐药菌株中检测到rrl基因A2266C 突变。李燕明等［20］对78 株堪萨斯分枝杆菌经PRA 分析，共得到4 个不同的亚型，即亚型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。其中亚型Ⅰ最为常见（56/78，71.8%）。亚型Ⅰ对CLR的耐药率明显高于其他亚型（26.8%；vs 4.5%；P=0.031）。在16 株对CLR 耐药的堪萨斯分枝杆菌中，有9（56.2%）株CLR 耐药分离株与23S rRNA 基因突变有关。以上数据提示堪萨斯分枝杆菌对CLR 耐药可能还存在其它机制，有待于进一步研究。

3.5 氨基糖苷类氨基糖苷类抗生素通过与核糖体A 位点附近区域结合而抑制蛋白质合成，发挥抗菌作用。氨基糖苷类抗生素对堪萨斯分枝杆菌有较好的体外抑菌活性。BAKUŁA［9］分析了5 株堪萨斯分枝杆菌分离株（亚型Ⅰ）对STR 的体外敏感性差异与编码30S 核糖体蛋白的rpsL基因和rrs基因序列差异的相关性：与低MIC 分离株（2 μg/mL）相比，MIC 值最高的堪萨斯分枝杆菌（＞64 μg/mL）存在均rpsLA128G（K42R）突变。这提示堪萨斯分枝杆菌与MTB 一样，STR 获得性耐药的产生由于rpsL基因突变所导致。

以上研究数据显示堪萨斯分枝杆菌对常用抗结核药物耐药可能与相关耐药基因的突变有关。然而，在刚刚发表的一项来自GUO 等［21］的研究中，对60 株分子分型均为Ⅰ型的临床分离株的常见治疗药物的药敏试验及相关耐药基因的序列分析结果显示：堪萨斯分枝杆菌均对RFB 敏感，对RIF、AMK、MXF 和LZD 的敏感率分别为80.0%、90.0%、88.3%和91.7%，但对CIP 和EMB 的耐药率很高，分别达到73.3%和76.7%；与结核分枝杆菌H37Rv 相比较，在所有堪萨斯分枝杆菌分离株中观察到12 个embCA突变，且所有分离株（不论耐药或敏感）均具有相同的rpoB、inhA、katG、rrl、rrs、rpsL、gyrA和gyrB基因序列。这项最新的研究结果表明：堪萨斯分枝杆菌的耐药机制不一定与上述已知的耐药基因突变有关。总体而言，关于堪萨斯分枝杆菌的耐药机制的研究数量有限，因此还缺乏得出可信结论的论据。亟待在这一领域开展更多工作，才能实现对堪萨斯分枝杆菌耐药机制有更深入的了解。

4 结语

近年来，堪萨斯分枝杆菌感染呈现上升趋势，准确快速鉴定堪萨斯分枝杆菌并对分型做出判断，有助于做出准确的疾病诊断，并对可用的药物有一定提示作用。而充分了解堪萨斯分枝杆菌对其常规化疗药物的耐药机制，可为建立快速的堪萨斯分枝杆菌分子药敏诊断方法提供数据支持，从而更好的指导堪萨斯分枝杆菌病的治疗。