红三叶草提取物中四种异黄酮的HPLC检测方法

李彦军，郑 楠，王加启，赵圣国

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

大豆苷元、染料木素、鹰嘴豆素A和刺芒柄花素是异黄酮类植物雌激素，具有抗氧化、抗炎和抗菌等生物学功能（Ludmila等，2019）。研究表明，日粮中添加大豆异黄酮可以改善动物的内激素水平（肖凡等，2020），提高断奶仔猪（林厦菁等，2020）、荷斯坦奶牛犊牛（肖凡等，2020）和羊的生长性能（毛玉平等，2019），以及机体的抗氧化能力（林厦菁等，2020）。大豆苷元和染料木素可以缓解奶牛泌乳后期产奶量的下降趋势，在一定程度上提高产奶量，乳蛋白质含量也明显增加（沈菲等，2020；Zhu等，2006），这可能是由于大豆苷元和染料木素促进了牛乳腺上皮细胞的增殖（刘春龙等，2010）。大豆苷元和染料木素还可以提高鸟类的产蛋性能和蛋壳质量，提高饲料转化效率（Cai等，2013；Akdemir等，2009）。另外，鹰嘴豆素A能改变瘤胃微生物的菌群结构，促进纤维素降解，提高日粮中蛋白质的利用率和肉牛的平均日增重，以及缓解瘤胃酸中毒（Harlow等，2021，2017a，2017b；Flythe等，2013）。红三叶草（Lemeziene等，2015）是大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆素A的主要来源。红三叶草是多年生的豆科植物，营养丰富、蛋白质含量高，是我国主要的牧草之一（巩建峰，1996）。因此红三叶草也是反刍动物摄入刺芒柄花素和鹰嘴豆素A等异黄酮的主要来源。王凯等（2017）表示红三叶草和苜蓿提取物可以提高羔羊的平均日增重和饲料转化率，这主要取决于鹰嘴豆素A与刺芒柄花素等其他异黄酮的交互作用（Harlow等，2020），这表明红三叶草提取物是一种潜在的可以提高动物生产性能和饲料转化率的天然饲料添加剂。

为了开发红三叶草提取物的相关产品，需要开发一种能够快速、全面、准确地测定产品中大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆素A含量的HPLC方法。目前，异黄酮的检测方法主要有紫外分光光度法（陈寒青等，2005）、气相色谱-质谱法（Iannone等，2019；Hossain等，2019）和高效液相色谱法/高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）（Zhou等，2020；李天雪等，2018；张念等，2011；Krenn等，2006；Delmonte等，2006）。HPLC法具有特异性强、灵敏度和准确性高的特点。虽然检测异黄酮的HPLC方法较多，但是能够同时检测红三叶草提取物中鹰嘴豆素A、刺芒柄花素、染料木素和大豆苷元的方法较少。因此，本实验旨在建立一种可以同时测定红三叶草提取物中大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆素A含量的HPLC检测方法，以期为红三叶草提取物产品中四种异黄酮的检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂Waters 2695高效液相色谱仪（Waters）；2998二极管阵列检测器（Waters）；KH-250DB型数控超声波清洗器（昆山禾利超声仪器有限公司）。

鹰嘴豆素A、染料木素、刺芒柄花素和大豆苷元标准品全部购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度均≥98%；甲醇为色谱纯，购自美国Fisher公司；无水磷酸氢二钠和盐酸均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；水为双蒸水；6号溶剂购自武汉奥莱特生物科技有限公司；红三叶草来自甘肃省岷县。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为χBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters）；流动相为甲醇（A）和10 mmol磷酸氢二钠溶液（B）；柱温为40℃；检测波长为270 nm；流速为1 mL/min；进样量为10 μL；洗脱梯度见表1。

表1 流动相洗脱梯度%

1.2.2 标准曲线的制作

1.2.2.1 标准溶液储备液的配制 分别准确称取鹰嘴豆素A、染料木素、刺芒柄花素和大豆苷元标准品20 mg（精确至0.01 mg）于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容，配制成浓度为200 μg/mL的储备液，于-20℃以下保存。

1.2.2.2 混合标准工作溶液的配制 分别准确量取10 mL上述标准品储备液于50 mL离心管，混匀，然后准确移取适量混合标准品溶液稀释，配成系列标准工作溶液，浓度分别为50、25、15、10、5、1 μg/mL。

1.2.2.3 标准曲线的制作 分别量取1 mL上述系列混合标准工作溶液通过0.45 μm滤膜。按照从低浓度到高浓度的顺序依次进样，每个样品连续进样两次，取平均值。以标准品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到各标准品的回归方程。

1.2.3 红三叶草提取物的制备 称取已经粉碎的红三草，加入10倍量80%的乙醇回流提取2次（每次2 h），过滤，合并提取液并减压浓缩，然后加入5倍量的热水（85℃以上）搅拌，冷却至室温后10000 g离心得到沉淀，加入5倍量的6号溶剂充分搅拌脱脂2次（每次2 h），最后10000 g离心，将沉淀物进行干燥得到红三叶草提取物。

1.2.4 检出限与定量线 将标准品混合溶液不断进行稀释，通过上述色谱条件进行检测，以3倍信噪比（S/N=3）时的浓度为最低检出限，以10倍信噪比（S/N=10）时的浓度为最低定量限。然后重复测定5次最低检出限和最低定量限浓度的标准溶液，记录峰面积和信噪比。

1.2.5 精密度 取5 μg/mL四种异黄酮的混合标准品溶液，在上述色谱条件下连续进样5次，测定其峰面积，并计算相对标准偏差。

1.2.6 稳定性 取5 μg/mL四种异黄酮的混合标准品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h按照上述色谱条件进样，测定其峰面积，并计算相对标准偏差。

1.2.7 加标回收率 准确称取4份6.25 mg红三叶草提取物，1份测定本底值，另外3份分别添加25、12.5 mL和7.5 mL浓度为50 μg/mL的混合标准品溶液，每份样品加盐酸甲醇溶液（1 mol/L盐酸）超声溶解后定容至50 mL容量瓶，每个水平制备5个平行样品，在上述色谱条件下测定四种异黄酮的含量，计算加标回收率。

2 结果

2.1 洗脱梯度的确定 本研究采用甲醇（A）和10 mmol的磷酸氢二钠溶液（B）作为流动相在不同的梯度洗脱下进行洗脱。结果表明，大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆素A在表1所述的洗脱梯度下分离效果良好，而且保留时间稳定（图1）。

2.2 检测波长的选择 通过对混合标准品溶液在210～400 nm波长进行全扫描（图2）发现，鹰嘴豆素A和染料木素在270 nm处具有最大吸收峰，281 nm和260 nm处 的吸收峰次 之，254 nm处的吸收峰最小，而大豆苷元和刺芒柄花素的响应值则是254 nm＞260 nm＞270 nm＞281 nm。因此，选用270 nm作为检测波长。

图2 大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆素A的光谱图和其在不同波长下的HPLC色谱图

2.3 柱温的选择 由图3可以看出，在上述色谱条件下，柱温为40℃时保留时间最短，吸收峰最大，35℃时保留时间次之，吸收峰最小，而30℃时保留时间最短，吸收峰仅次于40℃。所以40℃为最佳柱温。

图3 大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆素A在不同柱温下的HPLC色谱图

2.4 保留时间、最低检出限与最低定量限 四种红三叶草异黄酮保留时间、最低检出限和最低定量限的实验结果见表2。大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆素A的保留时间为（7.09±0.01）、（7.97±0.01）、（12.12±0.02）min和 （13.60+0.02）min，色谱峰分离效果良好；最低检出限分别为0.07、0.08、0.10 μg/mL和0.07 μg/mL；最低定量限分别为0.18、0.26、0.40 μg/mL和0.20 μg/mL。

表2 四种异黄酮的保留时间、最低检出限和最低定量限

2.5 标准曲线 由表3可知，在浓度为1～50 μg/mL时，大豆苷元（Y=71654X-30703）、染料木素（Y=71340X+1728）、刺芒柄花素（Y=50078X+29669）和鹰嘴豆素A（Y=75607X+36375）均具有良好的线性关系，线性方程的R2均大于0.999。

表3 四种异黄酮的线性关系

2.6 精密度 由表4可知，结果显示，大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆素A峰面积的RSD分别为1.80%、1.98%、1.35%和1.72%，表明该方法的精密度良好，符合分析方法对精密度的要求（李正邦，2016）。

表4 精密度实验结果

2.7 稳定性 由表5可知，看出大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆素A在常温下24 h时内峰面积的RSD分别为1.14%、0.90%、1.16%和1.06%，均小于1.2%，表明红三叶草提取中的这四种异黄酮在室温下放置24 h稳定性良好，符合分析标准的要求（李正邦，2016）。

表5 稳定性试验结果

2.8 加标回收率 由表6可以看出，大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆素A的平均加标回 收 率 分 别 为96.24%、100.05%、99.51%和100.18%，RSD分 别 为0.66%、0.94%、0.96%和0.95%，表明该方法具有较高的加标回收率，满足加标回收率为80%～120%，RSD＜10%的要求（李正邦，2016）。

表6 加标回收率的实验结果

3 讨论

3.1 洗脱梯度的确定 异黄酮在梯度洗脱时的保留时间和分离效果与有机相的起始比例密切相关。有机相起始比例越小，保留时间越长，分离效果越好（刘文静等，2017；张念等，2011；Krenn等，2002），因此确定甲醇的起始比例为20%。为了在缩短保留时间的同时提高分离效果，本试验发现在0～5 min将甲醇的比例从20%提高到40%时大豆苷元和染料木素能够完美分离，之后在5～20 min内将甲醇比例从40%提高到75%时刺芒柄花素和鹰嘴豆素A也能完美分离。因此确定了上述洗脱梯度，保证四种异黄酮分离后在短时间内洗脱掉其他干扰物质，同时平衡色谱柱，为下一次进样做准备。

3.2 柱温的选择 一般柱温越高，保留时间越短，但是温度过高会降低色谱柱的使用寿命，因此文献中报道最多的柱温是30、35、40℃（刘文静等，2017；Gao等，2015；Urpi-Sarda等，2008）。本实验结果表明，40℃时保留时间最短，吸收峰最大，35℃时的保留时间次之，30℃时保留时间最长，但是35℃时的吸收峰小于30℃的吸收峰。因此，实验选择40℃为最佳柱温。

3.3 检测波长的选择 据报道，鹰嘴豆素A的最大吸收波长为260 nm（Delmonte等，2006），也有研究以254 nm和281 nm为检测波长（李天雪等，2018；张念等，2011；Mustonen等，2006；Krenn等，2002）。在210～400 nm对鹰嘴豆素A等进行全波长扫描时发现，鹰嘴豆素A的最大吸收波长为270 nm，且该波长下具有良好的精密度和线性关系，这与Montero等（2018）报道称，270 nm处监测时线性关系差有所不同。另外，光谱图和色谱图显示染料木素和鹰嘴豆素A的最大吸收波长均为270 nm，在281 nm和260 nm处具有相同的吸收峰，在254 nm处的吸收峰最小；而大豆苷元和刺芒柄花素的最大吸收波长为255 nm，281 nm处的吸收峰最小，其次是270 nm和260 nm的吸收峰。

4 结论

本实验建立了一种同时检测鹰嘴豆素A、刺芒柄花素、染料木素和大豆苷元的HPLC检测方法，并通过方法分析学从线性关系、检出限、定量限、稳定性、精密度和加标回收率等方面对方法进行了评价，结果都符合分析标准的要求，可用于同时检测红三叶草提取物中的四种异黄酮。