粗甘油发酵生产1, 3-丙二醇的研究进展

蒋欢 马江山 曾柏全 张良波 李培旺，3

（1.中南林业科技大学生命科学与技术学院，长沙 410004；2.木本油料资源利用国家重点实验室，长沙 410004；3.湖南省林业科学院油脂分子构效湖南省重点实验室，长沙 410004）

随着化石资源日趋枯竭，生物柴油作为潜在替代品备受青睐，然而在生物柴油生产过程中伴随着大量副产物粗甘油的产生。平均每生产100 t生物柴油就产生10 t粗甘油。据统计，全球约有67%的粗甘油来源于生物柴油工业生产［1-2］。粗甘油中含有大量残留的甲醇、盐、催化剂、甲酯和游离脂肪酸等杂质，在未经预处理的情况下，其工业应用价值低［3］。随着全球生物柴油工业的持续快速增长，粗甘油产量将进一步增加，预测至2025年全球粗甘油产量将达到600万t［4］。粗甘油杂质多、价格低、产量大，其再开发利用途径主要分为三大类：第一，纯化精制成纯甘油，再进入传统甘油市场［5-6］；第二，直接进入动物饲料市场或生物燃料市场［7-9］；第三，开发成高附加值化工产品，如1, 3-丙二醇（1,3-propanediol，1, 3-PDO）和环氧氯丙烷等［10-12］。粗甘油的前两种利用途径受经济效益、市场规模和附加值低等影响，导致大量粗甘油无法得到有效处理和应用而被废弃。这不仅不利于生物柴油生产成本的降低，而且还可能成为一种新的环境污染源，从而阻碍生物柴油产业的可持续发展［8］。目前对粗甘油利用的研究热点主要开发为高附加值化工产品1, 3-PDO［13-15］。

1 甘油发酵生产1, 3-PDO

2 1, 3-PDO的主要生产菌株、代谢途径及关键酶

1, 3-PDO是一种重要的有机化工原料，广泛用于高分子材料、食品、医药、化妆品和化工等领域。其中，以1, 3-PDO作为单体合成聚对苯二甲酸丙二醇酯聚酯纤维（PTT），因其具有良好的弹性、抗污性、着色性及生物可降解性等优点备受关注［16-17］。随着全球市场对1, 3-PDO需求的迅速增加，1, 3-PDO的市场价值也快速攀升［18］。广阔的市场前景和巨大的商业价值使得如何实现低成本、高效、绿色环保生产1, 3-PDO成为当下研究热点［19］。目前，1, 3-PDO工业生产主要有化学合成法和生物法两种。传统的化学合成法主要分为丙烯醛法和环氧乙烷法，均具有成本高、产率低、依赖不可再生原料等缺点［20］。与化学合成法相比，生物法反应条件更温和、原材料来源广泛，而且对环境污染小，符合绿色化工的要求，有望逐步取代化学合成法［21］。生物法主要以甘油为底物，采用相应的微生物发酵，通过歧化反应，将甘油转化为1, 3-PDO。然而大部分的研究主要集中在以纯甘油为底物来发酵生产1, 3-PDO。一般而言，微生物受粗甘油中大量杂质的影响，其发酵过程中1, 3-PDO的产量、生产效率及生产强度等会明显低于纯甘油［22］。尽管可利用减压蒸馏、离子交换、活性炭吸附以及其它化学方法对粗甘油进行纯化，但成本昂贵。目前限制微生物生产1, 3-PDO工业化的主要原因之一是成本较高，而原料价格占整个成本的50%［12］。粗甘油价格低廉，通过开展能直接利用粗甘油发酵生产1, 3-PDO的微生物的筛选及耐受机制研究，将对降低1, 3-PDO生产成本和提升其经济效益具有重要的促进作用，这也是生物柴油下游产业的研究重点［23-24］。

自然界中能代谢甘油生产1, 3-PDO的微生物主要有肠杆菌属的克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）与产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）［25-26］；梭 菌 属 的 巴 氏 梭 状 芽 孢 杆 菌（Clostridia pasteuianum）、产气夹膜梭状芽孢杆菌（Clostridium perfringens）和丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridia butyricum）［27-29］；以及乳杆菌属的双科特迪瓦乳杆菌（Lactobacilli diolivorans）、罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri）和短乳杆菌（Lactobacilli brevis）等［30-32］。其中，克雷伯氏肺炎杆菌、巴氏梭状芽孢杆菌和丁酸梭状芽孢杆菌等3种细菌能以甘油为唯一碳源发酵生产1, 3-PDO，其转化率和生产强度均高于其他菌，因此对这3种细菌生产1, 3-PDO的研究更为广泛和深入［33］。

微生物代谢甘油途径分为氧化和还原两条分支：还原途径生成1, 3-PDO，氧化途径为菌体生长及还原途径分别提供ATP和NADH（图1）［34］。在还原途径中，甘油经甘油脱水酶（glycerol dehydratase，GDHt）的催化作用，脱去一分子水生成中间产物3-羟 基 丙 醛（3-hydroxypro-pionaldehyde，3-HPA），在NADH存在下，通过1, 3-PDO氧化还原酶（1,3-propanediol oxidoreductase，PDOR）催化3-HPA生成1, 3-PDO。在氧化途径中，甘油首先被甘油脱氢酶（glycerol dehydrogenase，GDH）催化脱氢，生成2-羟基丙酮（DHA），该过程同时伴随着NADH的生产；随后通过2-羟基丙酮激酶（dihydroxyacetone kinase，DHAK）催化生成磷酸二羟丙酮（dihydroxyacetone phosphate，DHAP），DHAP进一步转化成丙酮酸，并进入糖代谢途径生成其他小分子醇和酸等代谢产物，同时释放出ATP，为微生物生长提供能量［35］。氧化途径与还原途径通过NADH和NAD+相互转换偶联。微生物甘油代谢途径中主要涉及甘油脱氢酶、甘油脱水酶和1, 3-PDO氧化还原酶等关键酶。甘油脱氢酶属于NAD+依赖型酶，主要催化甘油生成DHA。不同来源的甘油脱氢酶结构不同，主要分为四聚体、六聚体和八聚体等3种结构［36］。甘油脱水酶是还原途径中控制甘油分解和1, 3-PDO生成的限速酶，对1, 3-PDO的合成速率和产率起着至关重要的作用［37］。甘油脱水酶分为辅酶B12依赖性和非依赖性两种，这两种甘油脱水酶编码基因序列并无同源性。前者存在于大部分微生物中，而辅酶B12非依赖性甘油脱水酶目前仅在丁酸梭状芽孢杆菌中发现［37］。1, 3-PDO氧化还原酶将甘油还原途径的中间产物3-HPA还原为1, 3-PDO，同时消耗NADH产生NAD+，维持细胞内还原力当量平衡［38］。

图1 微生物代谢甘油途径示意图Fig.1 Schematic diagram of microbial glycerol metabolic pathway

3 粗甘油对微生物发酵生产1, 3-PDO的影响

当前生物柴油工业生产工艺一般是以动植物的油脂与甲醇作为反应原料，在催化剂作用下，使油脂醇解生成生物柴油与副产物：甘油。反应过程中，使用的催化剂不同，其产生的粗甘油中甘油和杂质含量有较大差异。来源于生物柴油工业的粗甘油经过初步纯化后其甘油含量一般为65%-90%（W/W），此外还含有大量杂质，包括1%-2%脂肪酸、6%-13%醇类及 1%-8% 无机盐等［3，39-40］。

当微生物以粗甘油作为单一碳源发酵时，其1, 3-PDO 的产率及底物消耗速率等会明显低于纯甘油底物，这是因为粗甘油中含有的杂质对微生物菌体生长代谢以及酶活性等会产生严重抑制作用。由于不同微生物具有不同的生长和代谢特性，因此粗甘油中不同杂质对微生物生长和1, 3-PDO产率均有不同的影响。如Chatzifragkou等［41］发现粗甘油中对于1, 3-PDO发酵菌株C.butyricum VPI 1718发酵影响主要是不饱和脂肪酸类物质。由于不饱和油酸中双键的存在使分子发生扭结，弯曲分子与膜的相互作用通过阻碍营养物质和代谢物跨膜扩散而影响其运输，从而抑制菌株生长与1, 3-PDO生产，且油酸的不饱和度越高，抑制作用越大。Moon等［42］证明粗甘油中甲醇类物质对于1, 3-PDO发酵菌株C.butyricum DMS 15410发酵效率影响最大。高浓度的醇类物质对细胞膜流动性影响较大，通过改变细胞膜的通透性影响细胞生理活动，对菌株发酵产生抑制作用。Ito等［43］证实粗甘油中盐类物质对于甘油利用菌株Enterobacter aerogenes HU-101的抑制作用最大。高浓度盐离子可降低细胞脂质膜中的范德华力，并导致细胞膜肿胀，改变细胞内的生化过程，从而抑制细菌的生长代谢。Venkataramanan等［44］发现粗甘油中脂肪酸杂质对C.pasteurianum ATCC 6013转化甘油有着强烈抑制作用，而其他杂质如盐类和甲醇等杂质对细菌转化甘油的影响不大。Laura等［45］研究证明粗甘油杂质主要是对K.penumoniae DSMZ 2026发酵过程中1, 3-PDO产率产生了严重的抑制作用，但是对该菌发酵过程的菌体生长影响较小。本课题组开展的粗甘油杂质对K.penumoniae 2e发酵影响研究结果表明，不饱和亚油酸是影响菌株生长和代谢的主要杂质［46］。上述研究表明，粗甘油中杂质直接抑制微生物发酵及1, 3-PDO产量，从而制约其工业化应用，而粗甘油中不同杂质对不同微生物发酵的影响各有差异。

4 不同种属微生物发酵粗甘油生产1, 3-PDO

近些年来，已有不少学者开展了粗甘油直接发酵生产1, 3-PDO的研究，并筛选分离出多种耐受粗甘油杂质生产1, 3-PDO的微生物，尽管距离实现工业化应用还有众多尚待解决的问题，但是这些研究的开展将对于推动直接利用粗甘油工业化生产1, 3-PDO的实现具有重要意义。

4.1 肠杆菌属

对肠杆菌属以粗甘油为碳源发酵的研究，在近年来取得了较大进展。其中，K.pneumoniae是目前研究最深入的1, 3-PDO生产肠杆菌属之一［47］。有研究表明，K.pneumoniae以粗甘油为底物发酵时的甘油转化率及1, 3-PDO产量等均优于其他菌属，对粗甘油杂质具有高耐受性。如Yang等［48］研究表明，K.pneumoniae ATCC 8724分批发酵粗甘油时，1, 3-PDO最高产率和最高产量分别可达0.65 mol/mol和20 g/L，几乎与纯甘油底物发酵时1, 3-PDO得率相当。为提高菌株对粗甘油耐受性及1, 3-PDO产量，许多学者采用从特殊环境筛选或者诱变等方式获得粗甘油高产1, 3-PDO菌株。例如本课题组从生物柴油生产废渣污染土样中，分离筛选出一株粗甘油高产1, 3-PDO细菌K.pneumoniae 2e。该菌以粗甘油为底物发酵12 h后，其1, 3-PDO产率达0.64 mol/mol，与文献报道的同种属菌株相比优势明显，具有应用于工业发酵粗甘油生产1, 3-PDO的潜力［46］。

K.pneumoniae与大肠杆菌的生化与遗传特性相近，较易通过基因工程手段开展遗传改造和基因工程育种［25，49］。如 Oh 等［50］通过构建的 K.pneumoniae菌株乳酸和2, 3-丁二醇代谢途径缺陷突变体，利用粗甘油发酵生产的1, 3-PDO最大产量与发酵强度分别为81.1 g/L与3.38 g/（L·h），且乳酸和2, 3-丁二醇副产物显著减少。这表明通过基因工程手段对提高K.pneumoniae发酵粗甘油产1, 3-PDO得率的潜力巨大。值得注意的是，K.pneumoniae属于条件致病菌，如何去除或减少其致病性以保证其生产安全性，是其工业化应用前需要解决的重要问题［25］。尽管肠杆菌属中大肠杆菌本身不能利用甘油生产1, 3-PDO，通过基因工程技术对其进行遗传改造后，可获得发酵甘油生产1, 3-P DO的大肠杆菌工程菌株。例如，Clomburg等［51］将来自Citrobacter freundii菌株中甘油脱氢酶基因gldA及1, 3-PDO氧化还原酶基因yqhD转入大肠杆菌后，其利用粗甘油生产1, 3-PDO的产率可达21.3%，与纯甘油类似。此外，由于肠杆菌属生长速度快且对其进行遗传改造的技术较成熟，因此该菌属在发酵粗甘油生产1, 3-PDO工业中极具开发和应用前景。

4.2 梭菌属

梭菌属发酵甘油产1, 3-PDO的过程中需要严格的厌氧条件，其对甘油发酵过程中的底物和产物具有较高的耐受性，该菌属在对粗甘油转化效率方面具有优势。例如Wilkens等［52］筛选到一株生长快且高耐受杂质的菌株C.butyricum AKR102a，其利用粗甘油发酵生产的1, 3-PDO浓度达 76.2 g/L，生产强度为2.3 g/（L·h），其生产强度高于文献报道的其他野生菌株。通过基因工程手段，可有效提高梭菌属发酵粗甘油产1, 3-PDO的得率。例如，Wischral等［53］将大肠杆菌的甘油脱氢酶基因gldA和二羟基丙酮激酶基因dhaKLM转入C.beijerinckii DSM 791后，其发酵粗甘油生产1, 3-PDO的产率达0.54 g/g，相比野生型菌株提高了37.5%。Jensen等［54］采用化学试剂对一株C.pasteurianum菌株诱导突变后，其利用粗甘油发酵生产的1, 3-PDO产率达0.25 mol/L，生产强度为1.21 g/（L·h）。与野生型相比，其产率提高了48%。值得关注的是，梭菌属编码的甘油脱水酶是非辅酶B12依赖型，其在发酵过程中不需要额外添加辅酶B12来促进甘油脱水酶酶活，因此有利于工业化生产中降低生产成本［55］。此外，梭菌属为非致病菌，对工业发酵生产过程中的安全无影响。这些研究表明梭菌属具有成为粗甘油生产1, 3-PDO候选菌株的潜力［56］。

4.3 乳杆菌属

对乳杆菌属利用粗甘油生产1, 3-PDO的研究，目前主要开展菌种筛选。例如，Vivek等［31］分离筛选到一株能发酵粗甘油产1, 3-PDO的短乳杆菌L.brevis N1E9.3.3，其在厌氧培养条件下利用粗甘油生产的1, 3-PDO浓度可达18.6 g/L，产率为0.83 g/g。Grahame等［57］分离筛选出的一株面包乳杆菌L.panis PM1在碱性条件下（pH 9-10）对粗甘油发酵产1, 3-PDO的转化率达到71%。为了进一步提高乳杆菌属对粗甘油的发酵性能，已有不少学者通过改造其甘油代谢途径，有效减少了副产物生成量，获得高效发酵菌株。Vaidyanathan等［58］通过在中引入大肠杆菌乙醇脱氢酶编码基因（YqhD），可显著促进L.reuteri发酵甘油过程的中间产物3-HPA向1, 3-PDO转化，与野生型菌株相比，其转化粗甘油产1, 3-PDO的效率提高了34%，但该菌产乳酸和乙醇副产物的量增加了。推测其原因，可能是在其甘油代谢途径，引入的乙醇脱氢酶基因过表达后，对NADPH的消耗量增加，导致其原有的NADH依赖型1, 3-PDO氧化还原酶（PDOR）活性降低，使得产生的NADH更多地流向乳酸和乙醇生成途径。Pflügl等［59］对 L.diolivorans的 1, 3-PDO 氧化还原酶基因过表达后，与野生型菌株相比，其发酵粗甘油产1, 3-PDO产率提高了20%。这些研究表明通过基因工程手段对乳杆菌代谢甘油生产1, 3-PDO途径的定向改造，成为提高其利用粗甘油产1, 3-PDO效率的重要手段。此外，乳杆菌属作为1, 3-PDO的天然生产菌株之一，有着独特的优势，其属于非致病菌株，且发酵过程中也不需要严格的厌氧条件，预示着该菌属在发酵粗甘油产1, 3-PDO方面具有重要的发展前景。

5 混菌发酵粗甘油生产1, 3-PDO

混菌发酵主要是利用菌种之间协调互作关系，克服中间产物过多积累对发酵产物生成的不利影响，能提高微生物对发酵环境的适应性和产物产率。为了克服单一菌种发酵甘油产1, 3-PDO过程中转化率不高、性能不稳定等缺点，近些年来，有学者尝试通过混菌发酵方式来提高1, 3-PDO产率的研究。Pan等［60］采用梭菌与肠杆菌属混合菌株对粗甘油厌氧发酵时，1, 3-PDO产量高达0.44 g/g，且副产物乙酸的量显著降低；进一步采用Bacillus megaterium和Corynebacterium hydrocarbooxydans混合菌株对上述发酵液再次发酵，生产的1, 3-PDO纯度由最初的27.7%提高到接近100%。相比单菌发酵，混菌发酵方式还可以提高对粗甘油发酵过程中底物和产物浓度的耐受性。Zhou等［61］从活性污泥样中筛选出主要由梭菌属和肽链球菌属组成的厌氧菌群C2-2M，该菌群在甘油补料分批发酵中，生产的1, 3-PDO浓度高达57.86 g/L，生成的产物浓度相比单菌发酵提高幅度较大。Jiang等［62］从大连海域筛选出高耐受粗甘油杂质的菌群DL38，该菌群对粗甘油耐受浓度达200 g/L，生产的1, 3-PDO浓度达到81.4 g/L，转化率为0.63 mol/L。此外，通过混菌发酵方式对未经灭菌的甘油也具有较好的转化效率，例如Gallardo等［63］通过添加额外菌株至菌群DL38改造形成了新的菌群DL38-BH，该菌群利用未灭菌甘油生产的1, 3-PDO产量、转化率及生产强度均与底物经灭菌后的相当。这表明其具有应用于实际生产的巨大潜力（表1）。

表1 不同菌株或菌群利用粗甘油为底物发酵生产1，3-PDOTable 1 Production of 1，3-PDO by different strain or microbial consortium using crude glycerol substrate

混合菌群对粗甘油的高度适应是不同菌株共同作用的结果，利用微生物菌群混合发酵手段不仅可以提高粗甘油利用率、减少副产物的生成，还可降低下游工艺中目标产物的分离成本，为未来大规模利用粗甘油生产1, 3-PDO提供新思路。需要指出的是，菌群活性、结构组成及发酵性能等因素稳定性对发酵过程中的1, 3-PDO产率起着至关重要作用。而混合菌群经过长时间低温保存，其发酵性能有所降低，影响其在工业上应用。因此，如何提高保藏过程中菌群活性和稳定性，是混菌发酵应用于工业生产之前需要解决的关键问题之一［64］。

6 展望

在生物柴油产业规模化发展过程中，对伴随产生的大量副产物粗甘油如何进行有效处理已经成为影响该产业能否可持续发展的重要因素之一。通过微生物发酵将粗甘油直接转化成高值化学品1, 3-PDO，成为该副产物极具前景的高值化利用途径之一。其中，如何克服粗甘油杂质对微生物发酵抑制的影响，是未来实现粗甘油直接生物转化生产1, 3-PDO工业化应用亟待解决的关键问题。尽管目前通过自然筛选、诱变、基因工程等手段发掘出多种能直接发酵粗甘油生产1, 3-PDO菌株，但是对其相关功能基因在粗甘油底物发酵过程中的表达调控、功能酶对杂质耐受特性等从分子层面解析与粗甘油耐受机制相关的研究还很少见报道。同时，目前尚未有应用于实际生产的菌株开发出来。

为了进一步促进微生物发酵法转化粗甘油生产1, 3-PDO的应用，未来针对粗甘油高效发酵生产1, 3-PDO的研究可从以下三个方面开展：第一，开展对粗甘油高耐受微生物与耐受相关功能酶的发掘与研究，通过对其耐受特性、蛋白分子结构特征等方面探究，获取具有优良性状的酶资源；第二，对耐受粗甘油的功能基因的表达调控机制开展深入探究，以解析其耐受粗甘油的分子调控机制；对粗甘油高耐受微生物开展关键耐受功能酶资源的发掘与研究；第三，通过对微生物发酵粗甘油过程中副产物生成途径开展深入解析，为通过基因工程手段改造其代谢途径以减少副产物提供理论依据。基于上述研究结果，通过对微生物甘油代谢、1, 3-PDO生产途径中功能酶及与耐受相关基因的表达调控途径、副产物生成途径等通过代谢工程、分子生物学手段进行改造，提高微生物直接发酵粗甘油生产1, 3-PDO效率，促进其应用于工业生产。