高迁移率族蛋白B-1对结直肠癌放疗敏感性的调控作用机制研究进展

陈安祺，原娜，赵威威，郝晓慧，王聪，宋晓，张志林

1 河北北方学院研究生学院，河北张家口075000；2 河北北方学院附属第一医院放射治疗科

新辅助同步放化疗与局部晚期结直肠癌（CRC）的治疗密切相关，然而不同患者治疗后的反应存在显著差异。同步放化疗对肿瘤细胞的杀伤作用与肿瘤免疫微环境（TME）密切相关，这造成了同期别不同患者的手术切除率及预后相差甚大［1］。放射治疗可以引起肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡（ICD）［2］。高迁移率族蛋白B-1（HMGB-1）是一种组蛋白色素结合蛋白，它的释放是ICD 的主要特征之一。随着HMGB-1释放位置的不同而呈现不同的功能，因此其在放射治疗中扮演中极其复杂的角色［3］。在细胞内，HMGB-1 具有稳定染色体结构，利于DNA 转录和修复，并且促进溶酶体降解和维持细胞内稳态来驱使细胞发生自噬［4］。在细胞外，一方面HMGB-1促进T细胞的募集及其促炎因子的产生加强放疗的敏感性；另一方面，通过诱导抑制性免疫细胞导致抵抗放疗的作用［5］。临床研究发现，HMGB-1的升高与肿瘤的放射敏感性密切相关［6］。现就HMGB-1 对CRC 放疗敏感性的调控作用机制研究进展情况综述如下。

1 HMGB-1 通过介导细胞损伤调控CRC 放疗敏感性

1.1 HMGB-1 参与CRC 放疗相关的DNA 损伤 根据传统的放射生物学所述，电离辐射诱导的DNA 损伤包括碱基和脱氧核糖的损伤以及DNA 链的单链（SSB）或双链断裂（DSBs）［7］。此外，辐射通过对人体组织特别是肿瘤细胞的有机分子进行电离，产生自由基而使靶细胞受损。然而辐射诱导的DNA 损伤水平低于其修复能力，就会降低细胞死亡的概率［8］。因此，在细胞膜保持完整性的情况下，细胞的DNA 修复能力是决定细胞在亚致死辐射下存活的关键因素，也是评定肿瘤放疗敏感性的依据。

据报道，HMGB-1参与DNA损伤修复途径包括：核苷酸切除修复（NER）、错配修复（MMR）、碱基切除修复（BER）和双链断裂修复（DSBR）［9］。DNA 修复切除途径中是最常用的是NER，当DNA 被辐射受损后，HMGB-1 与DNA 损伤部位特异性结合并诱导螺旋进一步弯曲，这种扭曲可以帮助NER 装置更快的识别损伤，然后招募着色性干皮病（XPA）、复制蛋白（RPA）、DNA 修复的关键因子XPC-RAD23B 以及染色质重塑因子，去除核小体并促进受损DNA 进入修复装置，来开启染色质重塑的DNA 修复。在染色体背景下的DNA 修复包括三个步骤：“接近损伤—修复损伤—恢复原始染色质结构”。有研究［9］发现，在用DNA 损伤剂处理的小鼠胚胎成纤维细胞中敲除HMGB-1 后细胞存活率降低，重要的是DNA 受损后可诱导HMGB-1 的表达升高。为了进一步支持HMGB-1 在识别NER 蛋白方面的作用，LANGE 等［10］发 现HMGB-1 促进了XPC-RAD23B 和XPA-RPA 在受损DNA底物上的相互作用，同时，HMGB-1也能够与XPC-RAD23B 和XPA 结合。然而相反的报道［11］认为，HMGB-1可抑制顺铂诱导的DNA损伤的修复，被称为“修复屏障”。尽管目前关于HMGB-1在NER相关的修复作用是矛盾的，但研究数据更加偏向HMGB-1是NER的辅助因子。

HMGB-1 还与MMR 和BER 的修复作用有关，YUAN 等证实HMGB-1 在识别异源双链修复的初始损伤的基础上，与MSH2 和MLH1 基因结合并发挥修复作用［12］。PRASAD 等［13］发现，HMGB-1 不仅可与BER 途径中的中间体—脱氧核糖磷酸（dRP）裂解酶底物结合，而且可与APE、FEN-1 和polβ 结合，参与修复作用；进一步发现，HMGB-1对这种BER 中间体具有弱的5'dRP裂解酶活性，HMGB-1的dRP裂解酶活性比polβ低约600倍。

DSBR 的有两个子途径：包括非同源末端连接（NHEJ）和V（D）J 重组。HMGB-1 在V（D）J 重组和NHEJ 中也起着重要作用，即增强DNA 内外间的连接，并向DNA 断裂末端募集DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基（PKCs），甚至在缺乏互补性的情况下，HMGB-1 可以缩短DNA 双链体到断裂末端的距离，利于DNA修复［14］。HMGB-1还可以通过弯曲和环化线性DNA 链来提高DNA 的稳定性。然而，HMGB-1参与DSBR 修复还可能有助于癌细胞的放射抗性。SHRIVASTAVA 等发现，在各种尿路上皮肿瘤细胞中，HMGB-1 水平的增加与放射抗性有关［15］。此结果表明，HMGB-1可能通过其促进DSBR修复而发挥肿瘤耐受辐射的作用。

HMGB-1 不仅参与了四种主要的DNA 修复途径，还参与了细胞周期的调节。HMGB-1 结合晚期糖基化终产物受体（RAGEs）或T样受体群（TLRs）通路导致细胞活化，激活了细胞内信号通路磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）和丝裂原活化蛋白激酶如MAPK、ERK1/2来调节肿瘤细胞的活化和增殖。PI3K/Akt 可以激活细胞周期蛋白D，从而导致细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂p21 活性的下降，促进G1/S 期转变，因此HMGB-1 在细胞周期的调节中发挥着重要作用。另外抑制HMGB-1的表达可诱导细胞周期停滞在G0/G1期而使癌细胞对放射线敏感，从而增强了细胞凋亡［16］。

因此，HMGB-1 有效地介导了癌细胞的DNA 损伤修复并影响其放射治疗疗效。

1.2 HMGB-1 参与CRC 放疗相关的自噬 自噬是一种分解代谢途径，通过回收受损细胞器和关键蛋白质的溶酶体降解产物而维持自身能量水平，即自噬有助于细胞免于死亡。有研究表明自噬可能影响CRC 中的放射介导的生物学效应。肿瘤细胞经辐射损伤后，其可通过自噬来抵抗这些损伤，以维持自身的稳定性。研究人员发现通过干扰自噬可以克服肿瘤细胞耐药性并且增强肿瘤的放射敏感性。然而一旦出现过度自噬，细胞器和关键蛋白的降解将超过机体的代偿量，就会导致细胞死亡。这个过程被称为自噬性细胞死亡或II型程序性细胞死亡。实验研究发现通过利用药物或基因来增强辐射诱导的自噬会促进肿瘤细胞死亡，从而提高肿瘤细胞的放射敏感性［17］。总的来说，自噬显著影响放射治疗疗效，并有助于放射敏感性的增加。

HMGB-1 是自噬的关键调节因子，具有保护细胞免受辐射毒性的作用，其原因一方面可能是细胞质中的HMGB-1 通过分子内二硫键（C23/45）与Beclin1 结合从而将Beclin1 从其与Bcl2 的复合物中释放出来并诱导自噬。另一方面由于暴露于辐射的癌细胞显示自噬体的积累，以及Beclin-1 和微管相关蛋白LC3-Ⅱ水平的显著增加，从而导致自噬反应增强，其原因可能与LC3 Ⅱ点有关［18］。在一项乳腺癌研究中认为HMGB-1的下调可显著抑制放射治疗诱导的自噬，从而抑制乳腺癌放疗敏感性［19］。总之，辐射暴露诱导HMGB-1的升高增强了肿瘤细胞的自噬，导致肿瘤细胞放射敏感性增强。

2 HMGB-1 通过介导肿瘤微环境调控CRC 放疗敏感性

2.1 HMGB-1 参与CRC 放疗的免疫识别 免疫系统和恶性肿瘤细胞的相互作用是癌症发生发展的重要过程，一方面免疫系统可以通过多种免疫效应机制杀死和清除肿瘤细胞，另一方面，肿瘤细胞也可以通过各种免疫逃逸机制抵抗和逃避免疫系统对肿瘤细胞的杀伤或清除以利于自身的生长。辐射诱导的抗肿瘤免疫是由免疫激活信号和免疫抑制因子的相互作用产生的。肿瘤细胞被辐射损伤后，肿瘤抗原的释放和损伤相关的分子模式（DAMPs）可将TME塑造成免疫刺激模式，从而诱导有效的抗肿瘤免疫反应。其中，放射治疗诱导的DAMPs 包括钙网蛋白，热休克蛋白，5'-三磷酸腺苷和HMGB-1［20］。在免疫系统识别、活化和清除肿瘤细胞时，HMGB-1 的释放可增加免疫细胞的识别和清除。然而在正常细胞的程序性死亡时，HMGB-1 与细胞残余物紧密结合，因此组织中细胞外HMGB-1的升高可作为坏死的求救信号或坏死标志物。

辐射可诱导免疫抑制细胞的产生或数量的增加，包括肿瘤浸润性T 细胞、骨髓源性免疫抑制细胞，M2 型巨噬细胞及转化生长因子-β（TGF-β）和各种免疫检查点分子如程序性死亡受体1（PD-1）、细胞程序性死亡-配体1、细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4 等，可能会削弱放射治疗诱导的抗肿瘤免疫反应。HMGB-1 的升高可通过诱导免疫耐受影响放射治疗疗效。

2.1.1 HMGB-1 通过促进树突状细胞（DC）的成熟影响放疗的疗效 DC是一种有效的抗原呈递细胞，可识别肿瘤抗原并将其呈递至特定的T细胞来介导辐射诱导的适应性免疫反应。未成熟的DC 在抗原刺激下分化为成熟细胞，同时上调其表面的CD40、CD80/CD86 和主要组织相容性复合体，从而协同T细胞发挥抗肿瘤的作用。然而，TME 中的免疫抑制因子可抑制DC 成熟。据报道，HMGB-1 介导DC 的激活，并以剂量依赖的方式上调CD80/CD86 的表达［21］。此外，DC 成熟后会诱导HMGB-1 的分泌，从而上调趋化因子受体CXCR4 和CCR7，募集肿瘤细胞。同时，HMGB-1 的升高可通过HMGB-1-RAGE途径诱发DC 的募集。除了上述作用，HMGB-1 也可促进DC 产生各种细胞因子，如白介素-6（IL-6）、IL-12p70和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）参与免疫反应。KANEGASAKI 等研究［22］表明，辐射诱导的HMGB-1通过靶向CCL3，募集并活化DC 协助T 细胞杀伤肿瘤细胞。研究表明，HMGB-1 可通过刺激DC 成熟来增强放射治疗介导的癌症免疫反应的重要介质之一。

2.1.2 HMGB-1 通过促进T 淋巴细胞的募集影响放疗的疗效 放射治疗的疗效与肿瘤浸润的效应性免疫细胞的数量和功能有关。HMGB-1 可直接介导效应性免疫T 细胞的免疫反应，这可能与T 细胞的α1β2 直接活化有关。在小鼠试验中，HMGB-1 的阻断可影响T 细胞的活化。HMGB-1 也可通过调控T 细胞表面的CXCL11 促进T 细胞的募集。重要的是，肿瘤细胞死亡前释放的HMGB-1 不仅促进肿瘤抗原特异性T 细胞的活化，而且增加干扰素（IFN）-γ的表达，而IFN-γ 是驱动抗肿瘤免疫的关键因素［23］。这些研究均表明HMGB-1可能是通过诱导抗原特异性T细胞的免疫反应来增加放疗的抗肿瘤作用。

2.1.3 HMGB-1 通过介导调节性T 细胞影响放疗的疗效 放射治疗通过调控T 细胞免疫反应重塑TME，在此过程中，HMGB-1 有可能协助促进肿瘤免疫抑制细胞的形成，诱发免疫耐受和肿瘤免疫逃逸，进而影响放疗介导的抗肿瘤免疫。其中，调节性T细胞（Tregs）的形成及分泌产物如IL-10，是导致肿瘤细胞抗辐射及免疫逃避的原因。HMGB-1 可以上调转录因子Foxp3 以增强Tregs 的分化，其也可通过介导胸腺基质淋巴生成素来激活Tregs［24］。另外，HMGB-1 结合Tregs 表面的RAGE 不仅直接增强Tregs 的促肿瘤作用，而且促进Tregs 细胞分泌IL-10，抑制CD8+T 细胞的抗肿瘤效应［25］。因此，HMGB-1 与Tregs 的相互作用有可能增加肿瘤细胞的免疫逃逸，导致放疗疗效的下降。

2.1.4 HMGB-1 通过调节巨噬细胞影响放疗的疗效 巨噬细胞在免疫调节中起着十分重要的作用。研究［26］表明，HMGB-1 的表达与肿瘤巨噬细胞浸润呈正相关。肿瘤浸润巨噬细胞（TAMs）是M2型巨噬细胞，其可通过IL-10 和TGF-β 参与T 细胞的抑制。有趣的是，在膀胱癌模型中，与单独的放射治疗相比，放疗联合HMGB-1 抑制剂甘草甜素显著增加了抗肿瘤M1 型巨噬细胞的数量［27］。这表明HMGB-1抑制M1 型巨噬细胞对肿瘤细胞的控制。另外，肿瘤来源的HMGB-1 可有效的触发单核细胞分化为PD-1+的TAMs，显著增强IL-10 的表达，从而抑制CD8+T细胞增殖并促进食管癌的发展［28］。这些发现证实HMGB-1可以通过促进巨噬细胞的极化来抑制放射治疗介导的免疫反应。

2.1.5 HMGB-1 通过MDSCs 介导的免疫抑制影响放疗的疗效 髓系来源的抑制细胞（MDSCs）代表不成熟髓系细胞的异质性群体，包括肿瘤进展和慢性炎症过程中的粒细胞、DC 和巨噬细胞的前体［29］。MDSC 的弥漫性分布可能是驱动肿瘤转移和抗辐射的一个因素。机制可能是HMGB-1 提高了MDSC 在缺氧和营养缺乏的肿瘤微环境中的生存能力。曾有研究发现，HMGB-1不是直接抑制T细胞和B细胞的增殖，而是诱导MDSC 的增殖来介导促肿瘤效应，HMGB-1 的阻断，可显著抑制MDSC 的增殖［30］。机制可能一方面与激活NF-κB 信号通路有关，另一方面与骨髓祖细胞的刺激及分化有关［7］。因此，HMGB-1 的分泌可通过MDSC 介导的免疫反应而达到抑制放射治疗的作用。

2.2 HMGB-1 参与CRC 放疗过程中炎症因子的产生和释放 肿瘤细胞具有免疫抑制作用，能抵抗炎症细胞的浸润。机体受到辐射后，多表现为慢性炎症反应，以上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞的浸润为主。例如，经放射治疗后，肿瘤细胞周围可见多种促炎细胞因子如TNF、IL-1α 和IL-1β 等的产生，此时，HMGB-1 与免疫细胞表面的RAGEs 结合触发RAGE/JNK/NF-κB 炎症信号通路，促进和维持炎症反应［31］。此外，其不仅可通过自分泌方式诱导单核细胞释放TNF-α、IL-1α 等，而且可与DNA、脂多糖、IL-1β 和核小体形成复合物，促进炎症的形成。HMGB-1 也可直接激活内皮细胞并上调粘附分子Mac-1，诱导中性粒细胞的募集、粘附和迁移。此外，HMGB-1 与自然杀伤细胞表面的Toll 样受体2结合，进而启动NF-κB、STAT3 和Smad3 信号通路而诱导抗肿瘤免疫反应［32］。HMGB-1 通过激活细胞因子加速了放射治疗介导的肿瘤向“急性炎症”组织的转化，这对于适应性免疫反应的启动至关重要。

2.3 HMGB-1 参与CRC 放射治疗的肿瘤氧耗的形成 据文献报道，高达60%的晚期实体瘤由于氧的供应和消耗之间的失衡而表现出缺氧区域。肿瘤缺氧是造成肿瘤侵袭、转移及其对治疗的抵抗的不良因素。缺氧诱导因子1（HIF-1）是缺氧条件下的产物，是细胞缺氧的表现，放射治疗联合HIF-1 抑制剂可显著控制小鼠肿瘤细胞的生长［33］。还有研究［34］发现在CRC 细胞中，缺氧通过下调BTG3 来诱导放疗抗性。肿瘤中心的低氧环境可诱导炎症反应，释放HMGB-1 和线粒体DNA（mtDNA）等。研究证实，肿瘤细胞在缺氧条件下，HMGB-1 的表达升高促进巨噬细胞的浸润，并使其向M2 型极化，释放IL-6 以增强缺氧诱导的肿瘤细胞转移。同时HMGB-1 和mtDNA 的相互作用通过激活TLR9 来诱导肿瘤的生长，TLR-9 的激活触发炎症和肿瘤信号通路，进一步加速肿瘤的生长。因此，缺氧通过上调HMGB-1 来促进癌症的侵袭和转移，降低了CRC的放疗敏感性。

综上所述，HMGB-1 在CRC 放疗中的作用及其机制比较复杂，在细胞内参与DNA 的修复途径和细胞周期调节，甚至干扰细胞自噬直接作用于肿瘤细胞。在细胞外通过干扰免疫反应、炎症因子的释放以及肿瘤细胞的氧耗间接作用于TME，进而影响CRC 辐射敏感性，导致肿瘤细胞放射治疗效果的差异。所以，HMGB-1 的升高与肿瘤的放疗敏感性密切相关，可能是降低CRC 放疗的疗效一种存在机制。随着研究内容的不断深入，新的理论的创新，HMGB-1 与放疗敏感性机制的研究将会得以完善，也会有助于开发有效且靶向的肿瘤放射增敏的作用，为改善肿瘤放射疗效开辟新的途径。