免疫评分在结直肠癌预后评估中应用的研究进展

蔡颖峰，张家伟，钟晓刚

1 右江民族医学院研究生学院，广西百色533000；2 广西医科大学研究生院；3 广西壮族自治区人民医院结直肠肛门外科

结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤，也是恶性肿瘤相关死亡的第二大原因[1]。早诊断、早治疗是改善结直肠癌患者预后、减轻人群疾病负担的关键所在。TNM分期是目前评估结直肠癌患者预后最常用的手段，也是选择治疗方案的基础。然而，TNM分期相同的结直肠癌患者经历相同或相似的治疗方案后，临床结局却存在显著差别[2]。如大多数处于TNM分期Ⅱ期的结直肠癌患者在不使用辅助治疗的情况下，手术切除即可获得长期无病生存，但约20%患者需要辅助治疗才能获益，甚至部分晚期患者预后好于早期患者[3]。提示TNM分期在预测结直肠癌预后方面存在局限性，其原因是TNM分期只关注肿瘤细胞的特征，而忽略肿瘤微环境和免疫成分的影响，不能全面精确地预测结直肠癌患者预后。有研究报道，肿瘤微环境内宿主细胞的相互作用，如免疫细胞浸润，在肿瘤进展过程中具有至关重要的作用，与患者预后密切相关[4]。近年来，有学者提出了一种名为“免疫评分(IS)”的肿瘤预后评估新方法，通过免疫组化技术将肿瘤微环境中浸润的免疫细胞进行定量，以此来预测肿瘤患者生存期，并被证实对结直肠癌患者预后的预测效能优于TNM分期[5]。本文结合文献就IS在结直肠癌预后评估中应用的研究进展作一综述。

1 IS概述

肿瘤微环境是肿瘤细胞赖以生存的内环境，由肿瘤细胞、免疫细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、细胞因子、趋化因子和细胞代谢产物等构成。免疫细胞是肿瘤病变局部主要的细胞成分，在机体对抗肿瘤过程中发挥重要作用[6]。免疫细胞中的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)主要存在于肿瘤间质内，是肿瘤免疫反应的主要参与者。TILs是肿瘤微环境中最主要的免疫细胞，在免疫监视和免疫耐受中具有重要作用。有学者通过分析获得性免疫细胞在不同肿瘤区域的类型、功能、密度和位置，发现其与肿瘤预后密切相关，于是提出了“免疫结构”这一概念，用来描述肿瘤微环境。免疫结构包括肿瘤中心(CT)和侵袭边缘(IM)的细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)、记忆性T淋巴细胞(CD45RO+)，三级淋巴结构(TLS)以及一些功能分子，如Th1型细胞因子、趋化因子、黏附分子和细胞毒性因子[7]。随后GALON等[8]通过免疫组化技术观察了415例结肠癌患者CT和IM的原位适应性免疫反应，然后采用病理图像分析仪器对免疫细胞CD3+、CD8+、GZMB+、CD45RO+的免疫染色进行定量，发现未复发患者CT和IM的免疫细胞密度(CD3+、CD8+、GZMB+和CD45RO+)均高于复发患者，并且CD3+、CD8+、CD45RO+T淋巴细胞高密度与较长的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)密切相关。

基于上述理论，GALON等[9]提出了“IS”这一概念，通过量化肿瘤微环境中免疫细胞的密度来预测患者预后，并最先在结直肠癌患者中展开研究。一个国际共识小组就IS的预测效能进行研究发现，由CD3+、CD8+、CD45RO+、GZMB+T淋巴细胞密度等组成的IS是评估患者预后最好的方法。由于CD45RO背景染色和GZMB颗粒染色技术困难，故而采用最简单的膜染色(CD3+和CD8+)，并且这两个标记物在CT和IM区域的应用已在临床实践中得到验证[10]。IS的具体方法：首先对同时包含CT和IM区域的肿瘤组织进行切片，分别对切片进行CD3、CD8免疫组化染色；然后通过IS分析系统进行图像分析，精确定量CT和IM区域的CD3+、CD8+TILs密度，确定最佳临界值并划分为高密度和低密度，高密度为1分、低密度为0分；最后将CD3+、CD8+TILs密度在CT和IM区域的评分相加，即得到IS(总分0～4分)。IS除了在结直肠癌患者预后预测中具有重要的应用价值外，在预测治疗效果方面亦同样具有重要价值。

2 IS在结直肠癌预后评估中的应用

2.1 IS在非转移性结直肠癌中的应用 为了促进IS在非转移性结直肠癌中的应用，一项由癌症免疫治疗协会牵头的，由13个国家14个中心合作完成的，主要评估IS对TNM分期Ⅰ～Ⅲ期结肠癌患者复发时间(TTR)的预测价值。该研究2 681例结肠癌患者被随机分配到训练集700例、内部验证集636例和外部验证集1 345例，对每例患者CT和IM区域石蜡切片进行免疫组化处理后，定量检测CD3+、CD8+TILs密度。结果发现，在训练集中，高、中、低IS的结肠癌患者5年复发率分别为8%、19%、32%，高IS的结肠癌患者5年复发风险最低，并且这一结论在内、外部验证集中均得到验证[11]。这一结果表明，在评估结肠癌患者TTR、DFS和OS的准确性方面，IS显著优于TNM分期。一项关于IS在TNM分期Ⅲ期结肠癌患者预后预测价值的队列研究，评估了来自队列1(加拿大、美国)和队列2(欧洲、亚洲)的763例TNM分期Ⅲ期结肠癌患者的IS，主要观察终点是TTR，次要观察终点为OS、DFS、微卫星稳定状态(MSS)患者预后以及对化疗效果的预测价值。结果发现，低、中、高IS的结肠癌患者3年无复发率分别为56.9%、65.9%、76.4%，高IS与结肠癌患者较长的TTR、OS和DFS显著相关，在MSS患者中亦发现高IS与较长的TTR显著相关；接受化疗的结肠癌患者5年复发率为32.3%，未接受化疗患者为50.6%，并且无论是低危患者还是高危患者，化疗与高IS的结肠癌患者存活率显著相关，就复发风险而言，高IS的结肠癌患者在化疗中获益最大[12]。上述研究结果表明，IS不仅可预测结肠癌患者预后，还能预测患者对化疗的反应。此外，一项对TNM分期Ⅲ期结肠癌患者进行为期3、6个月的mFOLFOX(氟尿嘧啶/亚叶酸钙+奥沙利铂)辅助化疗发现，6个月疗程的mFOLFOX化疗方案效果要优于3个月疗程的该化疗方案[13]。在此基础上，PAGES等[14]对1 322例TNM分期Ⅲ期结肠癌患者进行IS，结果发现中、高IS的结肠癌患者在6个月疗程的mFOLFOX化疗方案中获益明显，包括低危和高危的结肠癌患者；而低IS的结肠癌患者在3、6个月疗程的mFOLFOX化疗方案中均未明显获益。由此可见，IS可用于优化TNM分期Ⅲ期结肠癌患者的辅助治疗决策。

2.2 IS在转移性结直肠癌中的应用 约50%结直肠癌患者在就诊时已发生肝转移,并且肝切除术后超过一半患者在两年内复发，这些复发患者的5年存活率只有37%～58%[15]。目前，临床风险评分(CRS)、IS等评分系统已被广泛用于预测结直肠癌肝转移(CRLM)患者预后。在可切除的CRLM患者中，肿瘤细胞与周围肝实质交界面的组织病理学生长模式(HGP)主要有3种：促结缔组织增生型HGP(dHGP)、替换型HGP(rHGP)、推进型HGP(pHGP)。其中，dHGP在促结缔组织增生边缘和正常肝脏的交界处通常可观察到密集的淋巴细胞浸润，肝切除术后患者预后良好[16]。LIANG等[17]对166例CRLM患者HE染色切片中的HGP进行评估后发现，dHGP患者CT和IM区域中浸润的CD3+、CD8+TILs密度高于非dHGP，并且dHGP患者无复发生存期(RFS)、OS较非dHGP患者明显延长，dHGP是独立于IS和CRS的CRLM患者有利预后因素。联合HGP、IS和CRS的风险评分能够对肝切除术后CRLM患者的生存状况进行分层，可作为一种预测CRLM患者预后的指标。BALDIN等[18]对221例不同术前治疗的CRLM患者临床病理特征和IS进行评估，在多变量分析中发现，IS和淋巴结转移数目、手术切缘、HGP和脂肪性肝炎等临床病理特征与患者术后复发有关。低病理学评分(PS)和高IS的CRLM患者复发风险最低，而高PS和低IS的CRLM患者预后最差。无论PS如何，高IS的CRLM患者较低IS的CRLM患者生存期明显延长。结合PS和IS可以对TNM分期Ⅳ期结直肠癌患者预后进行分层，并识别复发风险较高的患者。WANG等[19]对249例CRLM患者进行IS，结果发现IS>2分的CRLM患者RFS和OS较IS≤2分的CRLM患者明显延长。利用ROC曲线评估CRS和IS对预后预测的价值，结果发现IS在预测OS方面较CRS显示出更高的价值。IS可作为CRS的补充，用于预测肝切除术后CRLM患者预后。VAN DEN EYNDE等[20]对转移瘤和原发性结直肠肿瘤的免疫细胞类型进行量化发现，小的转移瘤通常IS较低，而IS高的患者淋巴结转移数量较少；较高的IS与患者较长的生存期和较低的复发率显著相关。

肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是肿瘤浸润性免疫细胞的另一个组成部分，对肿瘤微环境形成具有重要作用[21]。当巨噬细胞在肿瘤微环境中被激活时，被极化成M1、M2型。M2型巨噬细胞可产生血管生成因子和细胞生长因子，形成有利于肿瘤生长的环境[22]。KWAK等[23]采用免疫组化技术和数字图像分析仪对196例晚期结直肠癌患者石蜡包埋组织的原发灶CT、IM和远处转移灶(DM)进行检测，通过量化结直肠癌原发灶CT和IM中CD3+、CD8+TILs密度获得IS，分别在IS中加入DM的CD3+、CD8+TILs评分以及原发灶CT和IM的M2型巨噬细胞标志物CD163评分，得到IS-转移性模型(IS-M)和IS-巨噬细胞—附加性IS模型(IS-ma)。结果发现，IS、IS-M和IS-ma评分越高，晚期结直肠癌患者生存率越高，预后越好；多因素分析显示，只有IS-M是结直肠癌预后的独立预测指标。包含DM CD3+、CD8+TILs密度的IS-M预测晚期结直肠癌患者预后的效能要优于IS或IS-ma。对于转移性结直肠癌患者，RAS突变通常被用作抗EGFR治疗效果的重要预测因子。LIU等[24]检测了60例接受姑息性手术的转移性结直肠癌患者的RAS突变、IS和PD-L1表达，结果发现在高IS患者中，RAS野生型患者预后相对较好；Kaplan-Meier生存分析显示，RAS野生型患者OS长于RAS突变型患者，PD-L1高表达的RAS野生型患者预后更好。对于接受姑息性手术且PD-L1阴性表达的转移性结直肠癌患者，RAS突变是预后不良的一个重要因素。联合IS、PD-L1表达和RAS突变状态可作为接受姑息性手术后转移性结直肠癌患者预后的预测指标。因此，IS可作为预测转移性结直肠癌患者预后的生物标志物。

2.3 IS在结直肠癌生物标记物中的应用 伴微卫星不稳定(MSI)的结直肠癌有较高的免疫细胞浸润，可预示患者预后较好。有研究发现，IS在预测结直肠癌复发和生存方面要优于MSI。通过IS对免疫状态的评估提供了一个超越MSI预测肿瘤复发的有效指标，这可能对免疫治疗选择具有重要的指导意义[5]。MSI通常是由一组微卫星标记决定，其本质一般是单核苷酸，而在四核苷酸的微卫星中发现了另一种MSI形式，并命名为EMAST[25]。EMAST在体外与错配修复(MMR)特异性成员MSH3表达下调有关，而MSH3能够参与MMR中长内陷的修复[26]。WATSON等[27]筛选了149例接受手术治疗的TNM分期Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌患者，通过免疫组化技术和PCR技术分析这些患者PD-L1、EMAST表达并结合IS进行分析，结果发现EMAST阳性患者拥有较高的IS和PD-L1表达，并且EMAST阳性患者DFS、疾病特异性生存期(DSS)、OS明显延长。IS和PD-L1表达均较低的肿瘤在肿瘤微环境中缺乏免疫反应，并且复发率更高，复发时间更早。在MSI中结合IS能够更好地预测结直肠癌患者生存期。Claudins是参与紧密连接形成的完整膜蛋白，具有调节上皮细胞增殖、分化和迁移等作用，其在各种恶性上皮性肿瘤中表达上调[28]。有研究发现，高IS的结直肠癌患者Claudin-1表达缺失率明显降低，Claudin-1表达缺失的结直肠癌患者比存在Claudin-1表达的结直肠癌患者预后更差，故Claudin-1表达缺失可用于预测结直肠癌患者预后[29]。肿瘤微环境能够影响肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移。肿瘤进展位点2(TPL2)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，能够通过激活细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶通路来调节细胞增殖、侵袭和迁移等[30]。TPL2可能通过与肿瘤相关的炎症反应参与肿瘤侵袭和转移。PYO等[31]对262例结直肠癌患者构建组织芯片，检测TPL2表达并评估IS，结果发现TPL2高表达者比TPL2低表达者更易发生远处转移，TPL2高表达与结直肠癌患者较差的生存期和低IS有关。结果表明，TPL2表达可作为判断结直肠癌患者预后的指标之一，并有可能成为免疫治疗的一个重要靶点。一项分析程序性死亡蛋白配体2(PD-L2)在结直肠癌组织表达和预后作用中的研究，通过IS来评估TILs对PD-L2表达的影响，结果发现在免疫细胞中PD-L2表达与良好的肿瘤生物学行为和较高的生存率显著相关；免疫细胞PD-L2表达和PD-L1表达呈正相关关系；高IS的结直肠癌患者免疫细胞PD-L2表达明显高于低IS的结直肠癌患者，但高IS的结直肠癌患者肿瘤细胞PD-L2表达并不高于低IS的结直肠癌患者[32]。免疫细胞存在PD-L2表达的结直肠癌患者，无论是低pTNM分期还是高pTNM分期，预后均较好。免疫细胞PD-L2表达是结直肠癌患者预后较好的独立预测因子，是一个潜在的治疗靶点。以上研究表明，评估免疫状态的IS能够协助发现与结直肠癌预后相关的生物标记物以及挖掘潜在的治疗靶点。

2.4 IS结合其他技术在结直肠癌中的应用 由于IS只计算CD3+、CD8+TILs密度，并不能全面反映肿瘤局部免疫状况，需要结合其他技术来完善IS。越来越多研究者采用CIBERSORT算法来评估免疫微环境，通过从组织样本中提取RNA测序数据来分析免疫细胞组分[33]。WANG等[34]应用CIBERSORT算法最终选取了13种免疫细胞来构建新型IS模型，将875例结直肠癌患者按7∶3分配到训练集和测试集，结果发现在训练集和测试集中高新型IS的结直肠癌患者RFS明显低于低新型IS的结直肠癌患者；多变量Cox回归分析显示，新型IS是结直肠癌患者RFS的独立预测因子。该新型IS为结直肠癌患者无复发评估和风险分层提供了新的见解。人工智能可用于分析虚拟显微图像，并以较高的准确性来判断患者预后和肿瘤分子特征[35]。REICHLING等[36]研发了一个人工智能软件，对1 018例PETACC08队列TNM分期Ⅲ期结肠癌患者CD3、CD8染色玻片上的CT和IM区域T淋巴细胞密度和表面积自动定量，结果发现CT区域CD3+T淋巴细胞密度对患者预后的预测价值与经典的IS相似。将IM区域间质面积、DGMate(数字肿瘤参数)和CT区域CD3+T淋巴细胞密度组合，并命名为DGMuneS，其在评估患者预后效能方面优于IS。结果表明，在结直肠癌患者预后中，肿瘤基质和肿瘤细胞的内在变量以及与免疫细胞浸润相关的因素均应被考虑在内。DAWSON等[37]定义了一种新的评分方法——肿瘤出芽/T淋巴细胞评分(BTS)，即肿瘤出芽数除以T淋巴细胞数量，对345例TNM分期Ⅰ～Ⅳ期结直肠癌患者肿瘤组织芯片进行全细胞角蛋白及分别与CD3、CD8、CD45RO双重免疫组化染色，结果发现在预测淋巴结转移方面，较高的BTS比肿瘤出芽或CD8/CD3单独预测淋巴结转移的效果更好。因此，在IS基础上结合其他技术有望提高结直肠癌患者预后评估的准确性。

综上所述，IS是一种方便、快捷、稳定、经济的结直肠癌预后预测方法，其预后预测效能优于TNM分期。IS不仅可用于预测非转移性或转移性结直肠癌患者预后，还可用于预测免疫治疗或辅助化疗效果，指导个体化精准治疗策略。此外，IS还能协助发现与结直肠癌预后相关的生物标记物以及挖掘潜在的治疗靶点。不断地探索IS结合其他新技术，能够弥补IS的不足，未来期望能够优化出一个综合考虑肿瘤内环境各项因素的预后评分系统。目前，IS已被引入欧洲肿瘤内科学会结肠癌临床实践指南和世界卫生组织消化系统肿瘤分类，这为IS在结直肠癌中的应用铺平了道路。