系统性硬化病动物模型的研究进展

陈书媛，赵铖

广西医科大学第一附属医院风湿免疫科，南宁530021

系统性硬化病(SSc)是一种以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为特征的全身性自身免疫性疾病，其发病机制目前尚不完全清楚，临床亦缺乏行之有效的治疗方式。构建理想的动物模型是探索SSc发病机制和检测新治疗策略重要的临床前平台。根据构建方法不同，可将SSc动物模型分为诱导模型和基因模型两大类。其中，诱导模型包括博来霉素(BLM)诱导小鼠模型、慢性硬皮病样移植物抗宿主病(Scl-cGVHD)小鼠模型、活性氧离子(ROS)诱导小鼠模型、DNA拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)诱导小鼠模型、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导小鼠模型和Ⅴ型胶原(ColⅤ)诱导小鼠模型等，基因模型包括基因突变模型、转基因模型及基因敲除模型。虽然SSc动物模型较多，但迄今为止仍无一种能够完全模拟人类SSc疾病特征且易于推广的动物模型。本文结合文献就SSc动物模型的研究进展作一综述。

1 诱导模型

在诱导模型中，应用最为广泛、最为成熟的是BLM诱导小鼠模型和Scl-cGVHD小鼠模型。近年来，一些学者利用ROS、TopoⅠ、AngⅡ和ColⅤ等建立了新的诱导模型。诱导模型重点关注SSc的炎症反应和组织纤维化特征，而对SSc免疫反应和血管病变的关注相对较少，但诱导模型操作简便、成本低、造模成功率高。

1.1 BLM诱导小鼠模型 1976年，ASO等[1]通过BLM气管给药方式构建了小鼠肺纤维化模型。随后有学者通过皮下注射的方式建立了同时具备炎症反应、局部皮肤纤维化、肺纤维化以及自身免疫反应等特征的SSc样改变小鼠模型[2]，并沿用至今。目前，皮下植入渗透性微泵作为皮下注射的替代策略，解决了重复皮下注射存在的注射部位损伤和药物浓度分布不均匀等缺点[3]。不同品系小鼠对BLM的敏感度不同，BALB/c小鼠比C57BL/6、DBA/2小鼠更为敏感[4]。BLM诱导小鼠模型能够模拟SSc早期的炎症特征，已被广泛用于SSc发病机制的研究以及多种抗炎和抗纤维化药物的疗效评价。但该模型不适用于SSc后期非炎症阶段的研究。另外，该模型的纤维化表现局限于注射部位，无全身效应，自身抗体表达很低，并且几乎不能模拟血管病变。

1.2 Scl-cGVHD小鼠模型 1983年，有学者将B10.D2小鼠胫骨、股骨骨髓以及脾脏制成淋巴细胞悬液，并注射至亚致死照射的BALB/c小鼠，构建了Scl-cGVHD小鼠模型[5]。Scl-cGVHD小鼠模型早期即可观察到严重的炎症细胞浸润，并可见皮肤、肺、肝、肾以及肠道进行性纤维化以及自身抗体ANA阳性。该模型适用于模拟SSc早期的炎症阶段，然而由于移植技术较为复杂，并且移植后动物处于免疫抑制状态，易发生严重感染而死亡，造模成功率不高。有研究将BALB/c小鼠替换成Rag2基因敲除小鼠，这一改良使Scl-cGVHD小鼠模型更全面地模拟了人类SSc皮肤和内脏纤维化、血管病变以及抗Scl-70抗体阳性的特征，并且动物死亡率明显降低[6]。

1.3 ROS诱导小鼠模型 ROS是一种含有氧自由基的高活性化学物质，包括O2-、HOCL、ONOO-、H2O2等。2009年，SERVETTAZ等[7]首次建立了ROS诱导的SSc小鼠模型，该模型通过皮下注射ONOO-引起小鼠局部皮肤损害以及血清抗CENP-B抗体阳性，产生与人类局限性SSc相似的特征；皮下注射HOCL可引起小鼠弥漫性皮肤损害、肺纤维化、肾脏受累及血清抗Scl-70抗体阳性，产生与人类弥漫性SSc相似的特征。2019年，MENG等[8]进一步研究发现，HOCL诱导小鼠模型能够显示全身免疫细胞浸润、微血管损害和纤维化以及促炎和促纤维化途径激活。ROS诱导小鼠模型能够在BALB/c、C57BL/6、DBA/1、NZB等不同品系小鼠身上成功复制。与BLM诱导小鼠模型相比，ROS诱导小鼠模型在模拟血管病变方面更具优势，并且首次在小鼠体内同时模拟了人类SSc不同的临床类型，并证实抗Scl-70抗体直接参与SSc发病。目前，ROS诱导小鼠模型主要用于抗纤维化药物的研究。

1.4 TopoⅠ诱导小鼠模型 2011年，YOSHIZAKI等[9]通过皮下注射重组人TopoⅠ和完全弗氏佐剂(CFA)诱导SSc样病变，C57BL/6小鼠表现出皮肤和肺组织炎症、纤维化，并产生高水平的抗TopoⅠ抗体，炎症因子IL-6、IL-4、TGF-β1、IL-17等水平升高，IL-10水平降低；而IL-6表达缺失的C57BL/6小鼠皮肤和肺组织纤维化明显减轻。提示该模型可能通过IL-6诱导SSc样皮肤和肺组织纤维化以及自身免疫异常。2016年，MEHTA等[10]采用负载TopoⅠA和TopoⅠB多肽的树突状细胞重复免疫小鼠，亦可诱导出类似人类弥漫性SSc样的弥漫性皮肤纤维化和抗TopoⅠ自身抗体反应。TopoⅠ诱导小鼠模型的优点在于以TopoⅠ免疫为基础，再现了弥漫性SSc的特征，可用于研究TopoⅠ抗体在SSc发病机制中的作用。但该模型的缺点是无法模拟血管病变。

1.5 AngⅡ诱导小鼠模型 2012年，STAWSKI等[11]通过皮下渗透泵连续注射AngⅡ建立了SSc模型，该模型小鼠可表现出显著的真皮纤维化和炎症细胞浸润。2014年该团队进一步研究发现，AngⅡ诱导小鼠模型皮肤和心脏血管内皮血管损伤标记物显著增加，如vWF、TSP-1、MMP-12，而MMP-12缺失小鼠血管损伤、M2巨噬细胞聚集以及皮肤和心脏纤维化明显减轻[12]，提示MMP-12可能是一个SSc新的潜在治疗靶点。AngⅡ诱导小鼠模型能够模拟人类SSc组织纤维化、皮肤和心脏血管损伤，但该模型无法展现SSc发病时的自身免疫反应过程。

1.6 ColⅤ诱导小鼠模型 有研究报道，ColⅤ异常沉积与皮肤增厚和疾病活动度有关[13]，并被证实与SSc的自身免疫特征有关[14]。有研究通过对新西兰兔皮下注射人ColⅤ和CFA诱导出SSc样病变，该病变表现为皮肤和肺血管重塑、纤维化，ANA和抗Scl-70抗体阳性[15]。由于小鼠在可重复性、操作性及成本等方面较新西兰兔更具优势，2019年该团队改用C57BL/6小鼠建立了ColⅤ诱导小鼠模型，并成功复制了SSc的炎症反应、纤维化、血管病变和自身免疫特征[16]。在诱导模型中，ColⅤ诱导小鼠模型能够较为完整地复制SSc疾病特征，在未来的研究中具有更为广阔的应用前景。但ColⅤ诱导小鼠模型无法确定微血管疾病和炎症反应是否先于肺纤维化，并且触发SSc的机制尚不完全清楚。

2 基因模型

基因模型可分为基因突变模型、转基因模型及基因敲除模型。基因模型在模拟SSc组织纤维化和血管病变方面更具优势，能够在一定程度上弥补诱导模型的不足，但存在靶点单一、技术复杂、成本高等缺点。

2.1 基因突变模型

2.1.1 UCD-200小鸡模型 1981年，GERSHWIN等[17]建立的UCD-200小鸡模型被认为是目前对SSc疾病特征模拟最为完整的动物模型。该模型能够展现内皮损伤、小动脉闭塞、皮肤和内脏纤维化、多发性关节炎和自身免疫反应等SSc疾病特征。但UCD-200小鸡遗传表型具有异质性，目前对其遗传信息和分子基础的研究有限，并且该模型应用技术尚不成熟，难以繁育，价格昂贵，在应用中受到明显限制。

2.1.2 TSK小鼠模型 TSK小鼠模型包括TSK-1、TSK-2小鼠模型，其基因突变位点不同但表现相似。TSK-1小鼠模型为原纤维蛋白基因1发生的显性突变[18]，而TSK-2小鼠模型是由乙基亚硝基脲诱导1号染色体基因的显性突变，特别是Col3a1基因PIIINP片段的功能获得性突变[19]。TSK-1、TSK-2小鼠模型均能展现出皮肤纤维化和自身免疫反应的SSc样特征，但TSK-2小鼠模型在真皮下层和脂肪组织隔膜中可观察到单核细胞浸润，较TSK-1小鼠模型模拟更为全面。目前，TSK小鼠模型主要用于人类SSc晚期纤维化方面的研究，常与BLM诱导小鼠模型联合应用。但与SSc患者临床病理特征有所不同，TSK小鼠模型皮肤纤维化发生在皮下组织、位置深在，肺部受累以肺气肿样改变为主，几乎无纤维化，并且缺乏血管病变[18]。

2.2 转基因模型

2.2.1 Fra-2转基因小鼠模型 Fra-2是转录因子激活蛋白酶1家族成员之一，与炎症反应和胶原生成等密切相关。在SSc患者中可观察到Fra-2基因启动子的表观遗传学改变[20]。有研究在MHC-Ⅰ类抗原H2Kb启动子介导的Fra-2过表达小鼠中观察到肺纤维化，随后又在Fra-2转基因小鼠模型中发现进行性加重的皮肤纤维化和毛细血管减少、微血管内皮细胞凋亡和肺动脉血管闭塞及肺动脉高压(PAH)等典型血管病变，非常类似于SSc的肺动脉血管重塑和非特异性间质性肺炎表现[21]。2015年，VENALIS等[22]研究发现，Fra-2转基因小鼠模型能够模拟SSc相关心肌病的所有特征。Fra-2转基因小鼠模型能够高度模拟SSc的血管病变和纤维化这两大特征，可作为研究SSc血管病变和心肌损害的临床前模型，但该模型缺乏自身免疫病表现，并且PAH能够极大程度地降低小鼠寿命。

2.2.2 TGF-β相关转基因小鼠模型 TGF-β通路是参与SSc组织纤维化的重要通路之一。TBRICA；Cre-ER转基因小鼠是在TGFβRⅠ基因上游引入原α2(Ⅰ)胶原基因的转录增强子和他莫昔芬诱导Cre/loxP系统，小鼠出生后2周给予4-羟基他莫昔芬可激活组成性活性TGFβRⅠ表达，小鼠会逐渐出现全身性进行性真皮纤维化，但不会出现肺纤维化，并可见肾、肺和肾上腺动脉血管壁增厚[23]。另一种TGFβRⅡΔK转基因小鼠成纤维细胞中表达激酶缺陷型人Ⅱ型TGF-β受体，表现为真皮、肺、心脏和肠道纤维化，还能观察到血管纤维化[24]。这两种模型对研究TGF-β介导的组织纤维化具有重要价值，但这两种模型缺少自身免疫反应和炎症反应特征，并且模型建立需要条件性成纤维细胞转基因方面的特殊技术支持。

2.2.3 其他转基因模型 2011年，WEI等[25]建立的Wnt-10b转基因小鼠模型，能够表现出显著的纤维化和皮下脂肪萎缩，与典型的SSc皮肤病变特征相似。Wnt-10b转基因小鼠模型特别适合研究Wnt/β-catenin信号通路及其下游靶点以及脂肪细胞与真皮成纤维细胞的相互作用。2014年，MAURER等[26]构建的VEGF转基因小鼠模型，能够展现出明显的皮肤纤维化和增殖性血管病变。VEGF转基因小鼠模型可用于研究SSc发病机制中血管病变与纤维化的关系。

2.3 基因敲除模型

2.3.1 uPAR-/-小鼠模型 uPAR是参与ECM重构和血管生成的纤溶系统中的关键成分，可表达于内皮细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞以及免疫细胞等。2014年，MANETTI等[27]建立了uPAR-/-小鼠模型，该模型能够表现出真皮增厚、非特异性间质性肺炎和血管病变；随后有研究在该模型中发现了类似SSc相关心肌病特征的心脏受累[28]。但该模型缺乏免疫学异常相关的证据。

2.3.2 SIRT3基因敲除小鼠模型 SIRT3是一种线粒体定位的脱乙酰酶。有研究表明，SIRT3基因敲除小鼠随着年龄增长而自发出现多个器官纤维化，如心、肺、肝、肾[29]。PAULIN等[30]研究报道，SIRT3基因敲除小鼠模型能够发生PAH，表现为动脉壁增厚、总肺动脉阻力增加和右心室肥厚。该模型类似于SSc样组织纤维化和PAH，这为探讨炎症非依赖性纤维化和肺血管病变的发病机制提供了有利条件，但该模型缺乏自身免疫特征。

2.3.3 FLI1+/-KLF5+/-双杂合小鼠模型 FLI1是Ⅰ型胶原基因的有效抑制因子。由于FLI1在SSc患者成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞等表达均显著降低，已建立了多种细胞特异性条件的FLI1基因敲除小鼠模型。如上皮细胞特异性FLI1缺陷(K14Cre；fl/fl)小鼠模型具有多种SSc特征，包括自身免疫反应、炎症反应和组织纤维化，但没有血管病变特征[31]。此外，有学者将FLIfiox/flox小鼠与在内皮特异性Tie2(Tek)受体启动子控制下表达Cre重组酶的小鼠杂交，从而获得内皮细胞特异性FLI1基因敲除小鼠，该小鼠可表现出明显的血管病变特征[32]，并且参与维持血管稳态的分子表达下调[33-34]。但该模型缺乏SSc典型的组织纤维化和自身免疫特征。

KLF5是转录调节因子SP/KLF家族成员，在肾脏和心脏纤维化过程中发挥重要的作用。FLI1+/-KLF5+/-双杂合小鼠模型具备SSc的三个特征：皮肤和肺纤维化、血管病变、B细胞激活和自身抗体产生[35]。该模型小鼠在1月龄时可出现小动脉狭窄，2月龄时出现皮肤血管密度减少，3月龄时出现显著的真皮纤维化，8月龄时肺部表现为非特异性间质性肺炎、PAH和肺静脉闭塞性疾病的典型组织学特征。除了UCD-200小鸡模型外，FLI1+/-KLF5+/-双杂合小鼠模型是迄今为止模拟人类SSc疾病特征较为全面的动物模型。

综上所述，SSc动物模型种类较多，研究者应根据实际需求选用合适的单一或组合模型，以寻求最佳的实验结果。如BLM诱导小鼠模型、Scl-cGVHD小鼠模型主要用于研究SSc早期的炎性反应；ROS诱导小鼠模型和TopoⅠ诱导小鼠模型可用于复制人类弥漫性SSc；几乎所有模型能够模拟人类SSc的组织纤维化特征，但以TSK小鼠模型应用最广泛；UCD-200小鸡模型、uPAR-/-小鼠模型、SIRT3基因敲除小鼠模型、Fra-2转基因小鼠模型以及VEGF转基因小鼠模型等主要用于SSc血管病变的研究。UCD-200小鸡模型和FLI1+/-KLF5+/-双杂合小鼠模型是目前能够较为全面地模拟人类SSc疾病特征的模型，但UCD-200小鸡为禽类，与人类基因相差甚远，且基因模型普遍存在造模技术复杂、价格昂贵、不宜推广等弊端。此外，常用的啮齿类动物与人类种属和免疫学存在较大差异。因此，仍需进一步寻求一种遗传背景、免疫学等与人类更为接近、尽可能全面地模拟人类SSc疾病特征且易于推广的动物模型。