乳腺浸润性导管癌微环境中CD4+及CD8+T 淋巴细胞的表达及意义

王为东，陈文芳，张 祯

（1 山东省蒙阴县人民医院病理科 山东 临沂 276200）

（2 山东省蒙阴县人民医院乳腺甲状腺外科 山东 临沂 276200）

乳腺癌是全世界女性癌症死亡的重要原因之一，其病死率占所有恶性肿瘤的15%[1]。肿瘤微环境作为肿瘤赖以生存的基础，越来越受到该领域学者的重视。其中CD4+和CD8+淋巴细胞作为肿瘤微环境中的重要淋巴细胞，对肿瘤的预后的评估和治疗方法的制定都有重要的意义。本文旨在探讨乳腺浸润性导管癌微环境中CD4+及CD8+T 淋巴细胞的表达及其临床意义。

1.资料与方法

1.1 一般资料

分析2015 年1 月—2021年12 月于山东省蒙阴县人民医院行手术切除的136 例乳腺浸润性导管癌标本，所有标本经10%中性福尔马林、石蜡包埋处理。采用免疫组织化学染色方法检测肿瘤组织中的CD4+、CD8+水平。所有患者均为女性，中位年龄52 岁，组织病理学分级：Ⅰ级4 例，Ⅱ级90 例，Ⅲ级42 例；国际抗癌联盟TNM分期：Ⅰ期46 例，Ⅱ期51 例，Ⅲ、Ⅳ期39 例。

1.2 方法

①组织芯片构建：根据HE 染色切片选取组织典型部分，选用辽宁朝阳恒泰公司生产的恒泰组织芯片制备系统HT-1 制备蜡块，取样针直径2.0 mm，组织芯片间距1.5 mm。②免疫组织化学染色：采用免疫组化SP 法和罗氏BenchMark GX 全自动免疫组化染色机，CD4+、CD8+鼠抗人单克隆抗体北京中杉金桥公司，二抗采用罗氏公司全自动染色机封闭抗体，对比实验均设阴性和阳性对照，按说明书操作。

1.3 观察指标

应用组织芯片及免疫组化技术检测136 例乳腺浸润性导管癌微环境中CD4+及CD8+T 淋巴细胞的表达情况，并分析其与临床病理特征及预后的关系。CD4+和CD8+淋巴细胞阳性表达部位为胞质或包膜，挑选肿瘤间质淋巴细胞浸润密集区，采用视场数22，物镜倍数为×40 倍的奥林巴斯BX41 显微镜进行观察。判断标准：每个40倍视野中CD4+淋巴细胞≥20 个为阳性，＜20 个为阴性；CD8+淋巴细胞≥40 个为阳性，＜40 个为阴性。将不同临床病理指标与患者的肿瘤大小、淋巴结转移以及癌细胞的雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor, PR）、人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2, HER-2）、P53 及Ki-67 等指标进行分析，随访时间为24 ～72 个月。

1.4 统计学方法

使用SPSS 22.0 统计软件进行数据处理。计数资料用频数和百分率[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验；等级资料比较采用Z检验。经Pearson 检验进行相关性分析，采用Log-rank 检验进行生存分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2.结果

2.1 CD4+、CD8+淋巴细胞表达与临床病理指标的关系

CD4+T 淋巴细胞在乳腺浸润性导管癌微环境中的表达与患者的临床分期之间差异显著（χ2= 6.880，P= 0.032），与患者年龄、组织学分级、淋巴结转移及肿瘤的大小无显著差异（P＞0.05）；CD8+T 淋巴细胞在乳腺浸润性导管癌微环境中的表达与患者的淋巴结转移及临床分期之间差异显著（χ2= 4.248、7.496，P= 0.039、0.024），与患者的年龄、组织学分级及肿瘤大小无显著差异（P＞0.05），见表1。

表1 CD4+及CD8+T 淋巴细胞在IDC 微环境中的表达与临床病理参数的关系

2.2 CD4+、CD8+淋巴细胞与乳腺浸润性导管癌中ER、PR、HER-2 及Ki-67 表达的相关性

CD4+淋巴细胞在乳腺浸润性导管癌微环境中的浸润与ER 呈负相关（r= -0.173，P= 0.045），与HER-2 及Ki-67 呈正相关（r= 0.178、247，P= 0.039、0.004），与PR 无显著相关性（P＞0.05）。CD8+淋巴细胞在乳腺浸润性导管癌微环境中的浸润与ER、PR、HER-2 及Ki-67的表达均无显著相关性（P＞0.05）。

2.3 CD4+、CD8+淋巴细胞的浸润与术后无瘤生存和总生存的关系

Log-rank 检验显示，CD4+淋巴细胞在乳腺浸润性导管癌微环境中的浸润有延长患者的无瘤生存时间和总生存时间的趋势，但差异无统计学意义（χ2= 3.05、2.598，P= 0.081、0.089），见图1、2。CD4+淋巴细胞在乳腺浸润性导管癌微环境中的浸润可延长患者的无瘤生存时间和总生存时间，差异有统计学意义（χ2= 5.26、4.445，P= 0.022、0.035），见图3、图4。

图1 CD4+淋巴细胞表达患者无瘤生存时间

图2 CD8+淋巴细胞表达患者无瘤生存时间

图3 CD4+淋巴细胞表达患者总生存时间

图4 CD8+淋巴细胞表达患者总生存时间

3.讨论

肿瘤微环境是指肿瘤细胞周围的生长环境，是肿瘤细胞生长的土壤，包括基质细胞、免疫细胞及其分泌因子、血管内皮细胞及细胞外基质[2]。免疫微环境是指肿瘤局部浸润各种免疫细胞亚群，包括不同效应的CD4+T细胞亚群，初始和记忆性CD8+T 淋巴细胞、B 淋巴细胞，巨噬细胞，肥大细胞、树突细胞、自然杀伤细胞及其分泌因子。肿瘤免疫微环境已经被列为肿瘤的十大特征之一[3]。免疫细胞亚群的密度不同，患者的预后也不同。CD3+T 淋巴细胞、细胞毒性性T 细胞和记忆性T 细胞的密度越高，患者的无进展生存时间和总生存时间均显著延长[4]。在肿瘤生长早期，肿瘤免疫微环境中的免疫细胞及其基质成分形成的炎性微环境有抑瘤作用，可阻碍肿瘤的生长发展。但经过持续的免疫激活反应，微环境中的相关效应细胞处于耗竭或重塑状态，不能发挥正常的功能，甚至会促进肿瘤的恶性表征，继而改变免疫抑制性微环境[5]。

乳腺浸润性癌中的肿瘤浸润淋巴细胞的形态学评价与临床关系日益密切。淋巴细胞在肿瘤组织中的浸润程度可通过HE 染色及免疫组化染色进行评估[6]。浸润淋巴细胞具有潜在的评估治疗效果和预后的价值。早期检测淋巴细胞浸润情况适用于患者治疗方案的评估和制定，有助于提高治疗的针对性、降低复发率，改善患者预后[7]。

机体免疫监视机能的缺失使肿瘤细胞逃避机体的免疫监视是肿瘤的发生基础，其中由T 细胞和B 细胞介导的获得性免疫是有效且持续的抗肿瘤应答的关键基础。在肿瘤浸润淋巴细胞中，T 淋巴细胞的作用尤为重要。CD4+T 淋巴细胞为辅助性淋巴细胞，虽不能直接识别和杀伤肿瘤，但对细胞性T 细胞的活化具有辅助放大效应，间接发挥抗肿瘤作用。CD8+T 淋巴细胞属于抗肿瘤效应细胞[8]。肿瘤间质淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤主要有2 种途径：①通过分泌穿孔素和颗粒酶等致使肿瘤细胞自溶的分泌途径。②通过淋巴细胞的配体与肿瘤细胞的受体结合诱导肿瘤细胞的非分泌途径。

相关研究表明，在胃癌结肠癌患者外周血中CD4+及CD8+T 淋巴细胞明显降低显示预后不佳[9-11]。另有研究表明，CD4+及CD8+T 淋巴细胞越少，肿瘤间质血管的新生能力越强[12]。本文肿瘤微环境中CD4+及CD8+T 淋巴细胞越多，患者的临床分期越低，CD8+T 淋巴细胞还与患者的腋窝淋巴结转移相关（P＜0.05）。即肿瘤微环境中CD8+T 淋巴细胞越多，肿瘤腋窝淋巴结转移率越低。另外，随着CD8+T 淋巴细胞的增多，患者的无瘤生存时间和总生存时间均延长，差异有统计学意义。以上结果均表明，肿瘤微环境中CD4+及CD8+T 淋巴细胞能预测乳腺浸润性导管癌患者的预后，这也是肿瘤免疫治疗的理论基础之一。虽然随着肿瘤微环境中CD4+T 淋巴细胞的增多，患者的无瘤生存时间和总生存时间也有延长的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。考虑与样本的数量较少有关，今后将继续累积样本进行分析观察，同时对CD4+及CD8+T 淋巴细胞影响患者预后的机制进行探讨。

综上所述，肿瘤微环境中CD4+及CD8+T淋巴细胞越多，患者的临床分期越低。肿瘤微环境中CD8+T淋巴细胞越多，肿瘤腋窝淋巴结转移率越低。随着CD8+T淋巴细胞的增多，患者的无瘤生存时间和总生存时间均延长。可见，CD4+及CD8+T 淋巴细胞在乳腺浸润性导管癌微环境中的表达能有效预测患者的预后。