QuEChERS-UPLC-MS/MS检测餐饮小龙虾中5种生物碱

俞 灵，宋立华

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2.上海市食品药品检验研究院，上海 201203）

罂粟壳为罂粟科植物罂粟（Papaver somniferum）采完阿片后干燥成熟的果壳，含有20多种生物碱，其中以吗啡、那可丁、罂粟碱、可待因及蒂巴因等为主要生物碱成分[1]。食用添加罂粟壳的食品会使人产生某种程度的惬意和欣快感。一些不法商家和饭店为谋取暴利，在火锅、麻辣烫、牛肉粉及烤禽类等的汤料和辅料中添加罂粟壳、罂粟籽及其水浸物等违禁原料，使食物味道鲜美，以吸引更多的食客。消费者长期食用含有罂粟壳等类似物质的食物不但容易成瘾，还会对人体神经系统造成损害，并可能造成慢性中毒[2]。鉴于其危害，中国卫生部于2008年将罂粟壳列于《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》[3]中，国家多次明令禁止在食品中违法添加，有关部门也要求严厉查处，严格监管。因此，针对不同种类的食品，建立准确检测罂粟壳或其类似物中主要生物碱的分析方法，可为保证食品安全提供技术支持。

目前，关于生物碱的测定主要有分光光度法[4]、薄层色谱法[5]、气相色谱法[6-7]、高效液相色谱法[8-9]，但这些方法灵敏度较低，检测限高。生物碱分析常用的样品前处理方法主要有氯仿萃取法[10]、甲醇超声法[11]和固相萃取法等[12-14]，但是方法复杂繁琐。近几年有研究采用QuEChERS方法进行前处理[15]，利用气相色谱-质谱[16-17]或液相色谱-质谱联用法进行分析[18-22]，但多是围绕经常食用的火锅底料或食品汤料中生物碱的检测[23-27]。小龙虾作为日常餐饮中较受大众欢迎的食品，其季节性较强，小龙虾富含蛋白质，且餐饮小龙虾一般都含有较多油脂和辛香料，食品基质复杂，因此目前针对餐饮小龙虾中罂粟碱等生物碱的检测尚未引起关注，关于这类样品中生物碱的含量检测报道不多。食品基质、色谱分析条件及前处理方法等均会影响方法的检出限及灵敏度。因此，本研究旨在建立可用于测定餐饮小龙虾中吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可丁5种生物碱含量的QuEChERS-UPLC-MS/MS分析方法，为富含蛋白质及油脂类等基质样品中上述5种生物碱的检测提供可参考的技术数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小龙虾熟制品 购于川沙夜市摊，分别来自三个摊位，每个摊位三种口味（蒜蓉、麻辣、十三香），每种口味各500 g；吗啡（纯度99.1%）、可待因（纯度99.6%）、罂粟碱（纯度100%）、蒂巴因（纯度100%）、那可丁（纯度100%） 标准品，中国生物制品检定研究院；吗啡-D3（浓度1 mg/mL）、可待因-D3（浓度1 mg/mL） 美国Cerilliant公司；甲醇、乙腈、甲酸

均为色谱纯，美国Merck公司；甲酸铵（色谱纯）美国Sigma-Aldrich公司；氯仿、石油醚（60～90 ℃）、氨水、甲醇、盐酸、氢氧化钠 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；MCX柱 美国Waters公司；QuEChERS粉末（6 g无水硫酸镁与1.5 g无水醋酸钠的混合粉末） 北京艾杰尔科技有限公司；0.22 μm尼龙滤膜 天津津腾公司。

API4000质谱仪 美国AB SCIEX公司；Acquity UPLC超高效液相色谱仪、ACQUITY UPLCTM BEH HILIC色谱柱（1.7 μm，2.1×100 mm）、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1×100 mm）、MCX柱 美国Waters公司；MS3涡旋振荡器 德国IKA公司；5810R离心机 德国Eppendorf公司；B9500S超声处理器 上海Branson公司；超纯水机 Millipore公司；电子天平 Sartorius公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的制备 标准储备液：精密称取罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因标准品适量，用0.5%甲酸-甲醇溶液配制成罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因浓度均为1.0 mg/mL的标准储备液。

混合标准液A：精密吸取浓度为1.0 mg/mL的罂粟碱、那可丁、蒂巴因储备液各0.1 mL和浓度为1.0 mg/mL的吗啡、可待因储备溶液各0.5 mL于20 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，即得含罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为5 μg/mL和吗啡、可待因浓度为25 μg/mL的混合标准溶液A。

混合标准液B：精密吸取混合标准溶液A 0.3 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，即得含盐酸罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为150 ng/mL和吗啡、可待因浓度为750 ng/mL的混合标准溶液B。

同位素内标混合工作溶液（5.0 μg/mL）：分别精密吸取吗啡-D3、可待因-D3内标物质（浓度均为1 mg/mL）各1 mL置于200 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到吗啡-D3、可待因-D3的浓度均为5.0 μg/mL的混合内标溶液。

标准曲线溶液的制备：5种生物碱标准品分别用乙腈稀释，其中罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度分别为1～50 ng/mL，以罂粟碱、蒂巴因和那可丁的色谱峰面积为纵坐标，罂粟碱、蒂巴因和那可丁的浓度为横坐标绘制标准工作曲线；吗啡、可待因采用内标定量法（注：由于基质效应的影响），二者浓度范围为5～250 ng/mL（准确移取上述吗啡-D3、可待因-D3同位素内标混合工作溶液，加入制作标准曲线的溶液中，内标的质量浓度均为50.0 ng/mL），以吗啡和可待因的色谱峰与相应内标物面积的比值为纵坐标，吗啡和可待因的浓度为横坐标绘制标准工作曲线（见表1）。

表1 标准曲线线性范围（ng/mL）Table 1 Linear range of standard curve concentration range(ng/mL)

1.2.2 样品前处理 取小龙虾样品，去壳，搅碎，混匀，称取2.0 g（精确到0.001 g），分别采用如下提取方法：

方法一（70%甲醇-氯仿提取法）[11]：于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中，加入70%甲醇20 mL，超声处理30 min，放入离心机中，以4000 r/min的转速离心5 min，移取上清液，上清液蒸干，用0.1 mol/L的盐酸20 mL溶解，转移至分液漏斗中，加入石油醚（60～90 ℃）20 mL，振摇，弃去石油醚相，水相用氨水调节pH至9，用氯仿提取2次，每次20 mL，合并氯仿液，氯仿液蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL。0.22 μm滤膜过滤，取滤液待测。

方法二（0.1 mol/L的盐酸-氯仿提取法）[10]：于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中，加0.1 mol/L的盐酸20 mL，超声处理30 min，放入离心机中，以4000 r/min的转速离心5 min，移取上清液，上清液转移至分液漏斗中，加入石油醚（60～90 ℃）20 mL，振摇，弃去石油醚相，水相用氨水调节pH至9，用氯仿提取2次，每次20 mL，合并氯仿液，蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL。0.22 μm滤膜过滤，取滤液待测。

方法三（0.1 mol/L的盐酸-固相萃取法）[28]：于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中，加0.1 mol/L的盐酸20 mL，超声处理30 min，放入离心机中，以4000 r/min的转速离心5 min，移取上清液，上清液转移至分液漏斗中，加入石油醚（60～90 ℃）20 mL，振摇，弃去石油醚相，水相以3 mL/min通过MCX柱（先用3 mL甲醇，3 mL 0.1 mol/L的HCl活化），分别用10 mL 1 mol/L的HCl、20 mL 50%甲醇淋洗，再用含5%氨水的甲醇20 mL洗脱，蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL。0.22 μm滤膜过滤，取滤液待测。

方法四（QuEChERS法）[29]：于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中，加入吗啡-D3、可待因-D3混合内标溶液150 μL，再加入10 mL 0.1 mol/L的盐酸，涡旋1 min，超声处理30 min，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH呈中性，加入15 mL乙腈，剧烈震荡涡旋1 min，再加入6 g无水硫酸镁和1.5 g无水醋酸钠的混合粉末，涡旋混合1 min，放入离心机中，以4000 r/min的转速离心5 min，移取上清液，0.22 μm滤膜过滤，取滤液待测。

1.2.3 色谱条件 ACQUITY UPLCTM BEH HILIC色谱柱（1.7 μm，2.1×100 mm）；流动相：A为含0.1%甲酸的乙腈，B为含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液；柱温：室温；进样量：5 μL；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱条件如表2所示。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution procedure

1.2.4 质谱条件离子源 电喷雾离子（ESI）源；正离子扫描模式；雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气（大于99.999%）；雾化气压力：50 psi；气帘气压力：22 psi；去溶剂气压力：45 psi；喷雾电压：5500 V；去溶剂温度：500 ℃；碰撞气压力：5 psi；离子驻留时间：均为50 ms；各化合物的检测离子对、去簇电压（DP值）、碰撞能量（CE值）等质谱参数如表3所示（为本实验室前期建立的实验条件）[15]；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，仪器条件的设置可参考文献[15]。

表3 5种生物碱的保留时间、定性离子对、定量离子对和碰撞能量信息[15]Table 3 Retention time, qualitative ion pair, quantitative ion pair and collision energy information of five poppy shell alkaloids[15]

1.2.5 定性和定量分析 定性：在相同实验条件下测定标准溶液和样品溶液，若样品溶液中检出色谱峰的保留时间与相应标准溶液色谱峰的保留时间一致，且样品溶液的质谱离子对相对丰度与浓度相当标准溶液的质谱离子对相对丰度相比较，参考其它食品检测标准中相对离子丰度的最大允许偏差的数值，以及欧盟对农药残留测定法中有关液相色谱-串联质谱法定性判断的标准，相对离子丰度（k）的相对偏差不超过表4规定的范围，则可判定样品中存在该组分。

表4 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差Table 4 Maximum allowable deviation of relative ion abundance in qualitative determination

定量：罂粟碱、那可丁和蒂巴因采用外标法定量；吗啡和可待因采用内标法定量。

1.2.6 回收率实验 对实验用的9份小龙虾样品各称取2 g，分别加入混合标准溶液A（罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为5 μg/mL和吗啡、可待因浓度为25 μg/mL）30 μL，按照1.2.2中的方法四（QuEChERS法）进行样品前处理，以内标法计算吗啡、可待因的回收率，外标法计算罂粟碱、那可丁和蒂巴因的回收率。

1.3 数据处理

UPLC-MS/MS数据采集使用AB SCIEX Analyst software软件，处理数据和绘图采用g GraphPad Prism软件（version 7，San Diego，CA）；所有实验均重复三次，结果以平均值±SD表示。

按下式计算小龙虾中的罂粟碱等的含量。

式中：X表示试样中各待测物的含量（μg/kg）；c表示从标准曲线中读出的供试品溶液中各待测物的浓度（μg/L）；V表示样液的提取体积（L）；M表示试样的质量（g）；f表示样液稀释因子。

2 结果与分析

2.1 液相色谱-串联质谱条件的确定

2.1.1 色谱柱的选择 分别采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1×100 mm）、ACQUITY UPLCTM BEH HILIC色谱柱（1.7 μm，2.1×100 mm）进行测定，结果在酸性流动相（以含0.1%甲酸为水相）的条件下，吗啡、可待因在C18色谱柱上无保留，但在HILIC色谱柱上保留能力较强；在中性流动相（以10 mmol/L甲酸铵为水相）的条件下，吗啡、可待因在C18色谱柱上峰形拖尾，但在HILIC色谱柱上峰形对称。罂粟碱、那可丁、蒂巴因在两种色谱柱上均有较好的保留能力和峰形。综合上述结果，采用HILIC色谱柱进行分析。

2.1.2 流动相的选择 经预实验发现，在HILIC色谱柱上，流动相中含甲酸铵时，可显著改善各待测化合物的峰形，且甲酸铵的浓度变化对结果影响不大；流动相中的甲酸可延长罂粟碱、那可丁的保留时间，改善那可丁的峰形；流动相中乙腈的含量可显著影响各待测物的保留时间，通过调节乙腈的浓度，可使吗啡、可待因达到基线分离，有利于定性结果的判断。最终确定流动相组成为：含0.1%甲酸的乙腈及含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液进行梯度洗脱。

2.1.3 质谱条件的选择 罂粟碱等5种生物碱的电喷雾离子化效果均较好，故采用电喷雾离子化源进行分析。将0.2 μg/mL的标准溶液（利用注射泵设置流速为5 μL/min）通过三通管与流动相（流速为0.3 mL/min）汇合后注入到离子源中，在正离子模式下扫描，结果得到各待测组分的准分子离子峰。然后对各准分子离子峰分别进行扫描，选择响应最高时的DP值（去簇电压）后再进行子离子扫描，得到碎片离子信息。在MRM模式下，对各个子离子进行扫描，选取响应最高的CE值（碰撞气能量）后再分别对质谱中的离子喷雾电压、雾化气、干燥气流速温度等质谱参数进行优化。

综合上述结果，采用以含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵和含0.1%甲酸的乙腈为流动相，利用HILIC色谱柱进行分析。根据上述分析条件形成的标准溶液总离子流（TIC）图谱如图1所示，五种生物碱分离效果良好。

图1 吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因总离子流（TIC）图谱Fig.1 Total ion chromatograms of morphine, codeine,papaverine, noscapine and thebaine

2.2 样品前处理方法的确定

针对本研究所采用的四种前处理方法，利用样品加标实验对比考察提取效果，结果如图2所示：方法三（盐酸-固相萃取法）回收率最低，方法一（甲醇-氯仿提取法）和方法二（盐酸-氯仿提取法）虽回收率高于方法三，但操作较为繁琐，且试剂氯仿毒性较大，整体上方法四（QuEChERS法）回收率及重复性均优于其他三种方法，最终选用1.2.2中的方法四（QuEChERS法）作为样品的前处理方法。

图2 不同提取方法提取率比较Fig.2 Comparison of extraction rates of different extraction methods

2.3 定量分析方法的选择

为比较常用外标定量分析方法在5种生物碱中的应用效果，对实验用的9份样品各称取2 g，分别加入混合标准溶液A（罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为5 μg/mL和吗啡、可待因浓度为25 μg/mL）30 μL，按照1.2.2中的方法四（QuEChERS法）进行样品前处理，以外标法定量分析回收率。结果表明，吗啡和可待因的回收率范围为30%～80%，罂粟碱、那可丁和蒂巴因的回收率为80%～110%（图3）。说明利用外标法定量分析吗啡和可待因受样品基质效应影响较明显，而罂粟碱、那可丁和蒂巴因的基质效应较小。

图3 5种生物碱成分外标法定量的回收率Fig.3 Recovery rate of five alkaloids by external standard method

由于餐饮小龙虾为熟制品，富含油脂及各种调味料，且不同商家及口味其制作工艺也有区别，基质比较复杂，其中存在非挥发性组分与待测物质，在雾滴表面离子化的过程中产生竞争，影响电喷雾接口处的离子化效率，可能会增强或抑制被分析物离子的形成效率，产生基质增强或抑制效应，成为影响方法灵敏度和准确度的关键因素。为消除基质效应的影响，外标法一般可以通过稀释样品后进样分析或采用标准加入法。但是稀释样品溶液会影响方法检测的灵敏度；如采用标准加入法，基质的影响会使结果的重复性较差。吗啡和可待因均可获得到商品化的同位素内标。因此，本方法可采用内标法定量分析吗啡和可待因，采用外标法定量分析罂粟碱、那可丁和蒂巴因，以同时兼顾检测要求、实际可操作性及检测成本。

按照1.2.2方法四（QuEChERS法）及1.2.6回收率测定方法进行样品前处理，以内标法计算吗啡、可待因的回收率，外标法计算罂粟碱、那可丁和蒂巴因的回收率，结果如图4所示，五个化合物回收率范围均在80%～110%之间。

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线线性范围 标准曲线线性范围如表5所示，本实验方法吗啡、可待因线性浓度范围为5～250 ng/mL，罂粟碱、那可丁、蒂巴因线性浓度范围为1～50 ng/mL，线性范围内峰面积和进样浓度（ng/mL）呈良好的线性关系，相关系数均大于0.995，说明各目标化合物在线性范围内有很好的相关性。

表5 5种生物碱定量分析线性范围Table 5 Linear range of quantitative analysis of five alkaloids

2.4.2 检出限、定量限的确定 利用空白对照样品添加5种罂粟壳生物碱确定检出限、定量限，以3倍信噪比的检测浓度为方法检出限（LOD），以10倍信噪比的检测浓度为定量限（LOQ），结果表明罂粟碱检出限为0.6 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg；那可丁检出限为0.7 μg/kg，定量限为2.5 μg/kg；蒂巴因检出限检出限为0.8 μg/kg，定量限为2.7 μg/kg；吗啡检出限为3.7 μg/kg，定量限为12.4 μg/kg；可待因检出限为2.7 μg/kg，定量限为9.3 μg/kg（表6）。

表6 五种生物碱检出限及定量限Table 6 Detection limit and quantitative limit of five alkaloids

2.4.3 准确度和精密度分析 以准确度和精密度评价方法的有效性，称取18份样品（每份质量为2.0 g，n=6），分别设置了低、中、高3个浓度水平的回收实验，每个浓度水平进行6次平行实验。回收率结果如表7所示，从表中数据可看出加标回收实验回收率均在80%～110%之间，RSD在0.06%～8.20%之间，表明本方法具有较好的准确度和精密度。

表7 准确度与精密度结果（n=6）Table 7 Accuracy and precision results (n=6)

2.5 实际样品测定结果

为验证QuEChERS-UPLC-MS/MS方法检测餐饮小龙虾中5种生物碱的可行性，从川沙夜市摊购买了9份小龙虾熟制品，以本实验建立的检测方法进行分析，结果均未检出罂粟碱等5种待测组分，说明当地夜市摊小龙虾制品未有非法添加罂粟壳、罂粟籽及其水浸物等违禁原料。

3 讨论

首先，在样品前处理方面，蒂巴因、可待因、罂粟碱、那可丁均属于碱性有机毒物，与酸作用能生成易溶于水的盐，吗啡属于两性有机毒物，在酸性或碱性水溶液中均易成为溶于水的盐类，呈游离状态时能溶于乙腈等有机溶剂。本方法比较了盐酸-固相萃取法、甲醇-氯仿提取法、盐酸-氯仿提取法及QuEChERS法对这五种生物碱的提取效果，结果表明盐酸-固相萃取法（MCX柱）提取率最低，QuEChERS提取效果较好，这与胡争艳等[30]利用QuEChERS法提取含油脂类较多的火锅样品的结果有所不同，表明相同的提取方法，当食品基质不同时，提取效果有所不同，因此对于不同类型基质的样品，应选择合适的快速提取方法。

其次，在色谱分离的固定相选择方面，吗啡、可待因均为强极性化合物，目前已有将BEH HILIC柱用于吗啡、可待因、罂粟碱等物质的液-质联用分析[30-31]，本研究进一步对比了常用色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1×100 mm）与HILIC色谱柱（1.7 μm，2.1×100 mm）对5种生物碱的分离效果，结果表明罂粟碱、那可丁、蒂巴因在两种色谱柱上均有较好的保留行为，但吗啡、可待因在C18色谱柱上无保留，因此，若同时检测小龙虾中5种生物碱成分，采用亲水色谱柱（HILIC）效果较好。在流动相方面，目前对于检测罂粟碱类化合物，大都选用10 mmol/L甲酸铵-乙腈体系的酸性流动相[30,32]。本试验以0.1%甲酸为水相时，发现吗啡、可待因在C18色谱柱上无保留，但在HILIC色谱柱上保留能力较强；以中性流动相甲酸铵（10 mmol/L）为水相时，吗啡、可待因在C18色谱柱上峰形拖尾，而在HILIC色谱柱上峰形对称。罂粟碱、那可丁、蒂巴因在两种色谱柱上均有较好的保留能力和峰形，综合五种生物碱的保留行为，本方法选用0.1%甲酸的乙腈和含0.1%甲酸的甲酸铵（10 mmol/L）溶液为流动相，采用HILIC色谱柱进行分析可获得较好的分离效果。

本方法的检出限可达到0.6～3.7 μg/kg之间，定量限为2.0～12.4 μg/kg，此外，采用内标法定量分析吗啡、可待因的线性浓度范围为5～250 ng/mL，外标法定量分析罂粟碱、那可丁、蒂巴因的线性浓度范围为1～50 ng/mL，在线性范围内峰面积与进样浓度（ng/mL）间的相关系数均大于0.995。加标回收率为80%～110%，相对标准偏差小于10%，总体较已有部分方法有所改进[24,33]，可较好地满足市场监管的需要。

本方法的不足之处，为了消除基质的影响，采用内标法来对吗啡和可待因进行测定，但一般来说内标难以获得，且增加了分析费用，有待于进一步改进。

4 结论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱（UPLCMS/MS）联用法检测餐饮小龙虾中吗啡、可待因、那可丁、罂粟碱、蒂巴因5种生物碱的分析方法。利用QuEChERS前处理方法结合亲水色谱柱（HILIC），操作简单、迅速，方法的灵敏度高，准确度、重复性好，可以满足市场监管小龙虾或其他蛋白质含量较高的样品中罂粟壳生物碱残留量的需要。