中性粒细胞程序性死亡在白塞病发病中的作用

张孟昊，郑文洁

白塞病(Behçet’s disease，BD)是一种慢性全身性血管炎性疾病，以反复发作的口腔、生殖器溃疡、皮肤病变和眼炎为主要特征，可累及胃肠道、心脏大血管、中枢神经等全身多系统，发病机制未明[1]。中性粒细胞又称中性多形核白细胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)，其过度活化与浸润是BD急性炎症反复发作的主要原因，鉴于PMN在BD发病中的重要性，有专家建议将BD命名为中性粒细胞性血管炎[2]。PMN的半衰期极为短暂，通常只有18～19 h[3]，因此了解PMN的死亡方式对BD发病机制的探索至关重要。

1 PMN的亚群

在Ficoll密度梯度分离程序中与红细胞位于同一沉降区，为正常密度中性粒细胞；与单个核细胞位于同一沉降区的PMN为低密度中性粒细胞(LDG)[4]。LDGs是PMN的一个新亚群，能分泌比正常密度粒细胞更高水平的白细胞介素(interleukin，IL)，如IL- 6、IL- 8、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和Ⅰ型干扰素(interferon，IFN)，表现出促炎的特性[5]。

2 PMN的主要功能

PMN是宿主对病原体的首要防御细胞。被激活后可释放活性氧(reactive oxygen species，ROS)和颗粒蛋白酶，吞噬病原体，而后转化为脓细胞并死亡[6]。过度活化的PMN可以造成组织损伤，破坏免疫耐受并产生自身抗体，促使自身免疫性疾病的发生[7]。

PMN可促进树突状细胞(dendritic cells，DC)活化和巨噬细胞(macrophages，Mφ)抗炎重编程[8]，诱导B细胞增殖分化[9]，促进Th1和Th17的分化[10]，放大免疫反应。

3 PMN的程序性死亡方式

PMN半衰期仅18～19 h[3]，其常见的程序性死亡方式包括细胞凋亡、中性粒细胞细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)形成(NETosis)、细胞焦亡和铁死亡。

3.1 细胞凋亡

细胞凋亡是生理状态下由基因调控的死亡方式。PMN凋亡障碍将导致炎症反应加剧和全身性炎症反应综合征[11]。凋亡的PMN若不即使被清除则会释放颗粒酶及损伤相关的分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，引起局部炎症和组织损伤[12]。

3.2 NETosis

NETs是炎性期激活的PMN胞浆抗菌蛋白附着于解聚的染色质上形成的网状结构，被释放到胞外可以包裹杀伤外来病原体[13]。但过度形成或未及时清除的NETs可直接导致组织损伤；也可以作为新表位参与自身免疫性疾病的发生[14]。

3.3 细胞焦亡

2001年cookson等首次使用焦亡形容半胱氨酸蛋白酶(caspase，CASP)依赖的细胞死亡方式[15]。焦孔素D(gasdermin D，GSDMD)被CASP切割后，GSDMD-N移位到质膜诱导细胞膜孔隙形成，而GSDMD-C则可以抑制N端的焦亡诱导活性[16]。但在PMN中N-GSDMD并不会聚集到胞膜引起焦亡，而是与嗜蓝颗粒和LC3+自噬体相关[17]。

3.4 铁死亡

铁死亡是一种新型程序性细胞死亡方式，最早由Stockwell等[18]提出，是铁超载和脂质ROS累积所致，伴随DAMPs的释放，介导炎症[19]。谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)可以降低脂质过氧化物度[20]，警告免疫细胞正处于铁死亡敏感的环境中。缺血再灌注损伤后的细胞铁死亡会进一步导致DAMP的释放和炎症的发生[21]。

细胞的死亡方式主要取决于“刺激物”和被激活的受体[22]，通过启动相应的信号级联反应，执行不同的细胞死亡方式。而且不同的细胞死亡方式发生的快慢不同：细胞焦亡很快，而凋亡却很慢。因此，PMN的死亡可能是细胞不同死亡方式综合作用的结果。表1总结了常见PMN程序性死亡的方式以及各自的特点。

表1 常见的PMN程序性死亡方式及其各自特点Table 1 Common modes of PMN programmed death and their characteristics

4 PMN的程序性死亡方式在BD发病中的潜在作用

4.1 细胞凋亡

PMN数量、功能稳定以及凋亡PMN快速有效的清除，是维持机体稳态的关键，活动BD患者体内存在PMN凋亡调节机制的紊乱。中粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)是一种促进粒细胞增殖和成熟的生长因子，在调节PMN生存稳态中发挥特定作用[23]。研究发现活动BD血清G-CSF水平增高，且PMN自发凋亡比例显著高于健康对照；但加入自体血清共培养后，BD的PMN凋亡被明显抑制，提示活动BD血清中的G-CSF通过刺激PMN的增殖和激活，并抑制其凋亡，维持BD炎症状态[24]。男性BD患者中PMN凋亡紊乱强于女性患者，可能与睾酮有关[25]。但也有研究发现BD患者的葡萄膜炎缓解期PMN凋亡减少，而活跃期上升，可能是凋亡细胞通过Fas-Fas配体相互作用的结果[26]。一项前瞻性临床研究发现局部应用G-CSF 可以显著降低 BD 患者口腔、外阴溃疡的愈合时间和疼痛严重程度[27]。因此，PMN凋亡调节机制的紊乱可能是BD疾病进展的一个早期、生物学相关的危险因素。

4.2 NETosis

NETosis是目前在BD领域研究最多的PMN程序性死亡方式，可以被病原体、PMA以及唾液酸Lewis(X)等物质诱导[28]，但其机制和产生NETs的性质不同。研究显示来源于活化血小板的可溶性CD40配体(soluble CD40 ligand，sCD40L)可以通过P3K/NF-κB信号通路引起呼吸爆发，使PMN处于活化状态，也可促进PMN黏附、迁移[29]。活动BD血浆中sCD40L水平较健康人和非活动BD明显升高，NETs增多[30]。BD患者体内游离NETs水平及体外PMN产生NETs能力均强于健康对照[31]；同时在BD患者针刺反应的表皮[32]、脂膜炎、血管壁或心脏内血栓[33]病理组织中，均有发生NETosis的PMN浸润。推测PMN在BD体内即处于活化状态，通过产生过量的NETs直接参与BD发病，造成组织器官损伤。此外，口腔中唾液粘蛋白上的唾液酸 Lewis(X)可以与PMN的l-选择素结合，诱发不依赖NADPH 氧化酶、弹性蛋白酶和整合素的NETosis。与病原体诱导的 NADPH 氧化酶依赖性 NETosis 相比，唾液诱导的NETosis发生得更快，有着不同的蛋白谱和更高的Dnase抗性，且具有更强的杀菌的能力。但BD患者唾液中不含蛋白质的部分抑制了粘蛋白诱导 NETosis 的能力，导致口腔内NETs水平降低，NETs抗菌能力下降，口腔溃疡发生[28]。

NET s的另一个重要来源是LDGs[34]，LDGs产生促炎因子和NETs的能力均强于正常密度PMN，且LDGs可以通过增强NETosis而引起内皮损伤和血管功能障碍[5，34]。近期研究表明，低密度粒细胞-淋巴细胞比率能敏感的反应BD的活动状态，且有血管受累的BD患者LDGs比例明显增多[35]，提示LDGs与血管炎症有关。

BD来源NETs可以抑制内皮细胞增殖，促进内皮细胞凋亡、坏死[36]。损伤的内皮细胞募集PMN并表达大量血管内皮生长因子，诱导形成新生血管并合成一氧化氮，导致血管扩张，破坏内皮细胞完整性，使炎症细胞浸润到血管全层，导致疾病的不断发作[37]。此外，PMN活化后产生ROS增多，启动NETosis，并导致血栓形成[38]。

2021年本团队研究发现活动BD外周血及血清NETs含量均升高，且血清NETs含量与BD疾病活动指标CRP呈正相关。并首次发现BD NETs中高水平的组蛋白H4和氧化DNA可介导巨噬细胞活化，产生更多 IL- 8 和 TNF-α 等促炎细胞因子，并进一步促进Th1 细胞分化，发挥免疫调节功能[39]。

抑制中性粒细胞的过度活化和NETosis将有利于改善BD疾病严重程度[40]，体外研究显示秋水仙碱和地塞米松这两种用于治疗BD 的药物均能抑制BD外周血NETosis水平[36]，但目前暂无体内验证。

4.3 细胞焦亡

多种免疫细胞均可以发生焦亡：BD外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和皮损中发现NLRP3表达增加，且IL-1β分泌增多，而CASP-1抑制剂会抑制其增加[41]，提示BD患者的PBMC可能存在焦亡的增加；肠BD患者的肠粘膜组织中观察到了焦亡相关蛋白的表达升高，是血浆中的外泌体通过激活NLRP3诱导肠上皮细胞焦亡导致的[42]。目前尚无BD中PMN焦亡的相关研究，但鉴于多种自身炎症性疾病都已被证实与细胞焦亡存在密切联系[43]，因此探究PMN焦亡在BD中的作用机制将有助于深入探索BD发病机制。

4.4 铁死亡

PMN的铁死亡目前在自身免疫/炎症性疾病领域的研究凤毛麟角，仅在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)患者血清中发现脂质ROS升高和PMN的铁死亡[44]。且PMN铁死亡伴随自身抗原的释放，通过刺激自身反应性B细胞和pDC产生自身抗体和Ⅰ型IFN，形成一个正反馈环。提示PMN的铁死亡不仅是SLE患者白细胞减少的重要原因，而且能够诱导发生级联病理反应进而促进SLE的发生发展。鉴于PMN在BD发病机制中的重要作用，PMN铁死亡在SLE患者中的成功探索为此后对BD患者PMN铁死亡促炎机制的研究提供了启发。

综上，PMN作为人体中含量最多的白细胞，除直接在炎症部位浸润、脱颗粒并发挥吞噬作用致组织损伤外，其程序性死亡方式的调控也与BD发病有关。多项研究表明BD患者PMN凋亡和NETosis机制的紊乱，可直接或间接诱导炎症反应，促进组织器官损伤。BD患者体内PMN 凋亡机制受损时，颗粒酶及DAMPs释放将引起局部炎症和组织损伤。NETosis与BD疾病的活动性及组织损伤密切相关：过度激活的PMN释放的NETs装配有生物活性的蛋白，可直接导致组织器官损伤；NETs也可以损伤内皮细胞，介导炎性血栓形成；或激活T 淋巴细胞，扩大炎症反应，间接参与BD的发病和病情的恶化。虽然目前尚无BD中PMN焦亡或铁死亡的报道，但随着该死亡方式在其他自身免疫性疾病或在BD患者其他免疫细胞中的深入探索，可为BD中PMN焦亡或铁死亡机制的研究提供思路。深入探讨BD患者PMN的多种死亡方式，可进一步解析PMN参与BD发病的重要节点，有望为BD的临床治疗提供新靶点。