MTHFD2的生理作用及其在恶性肿瘤中的研究进展

邓新喜，傅斌，刘霄强

（1.九江市第一人民医院；2.南昌大学第一附属医院，南昌 330000）

亚甲基四氢叶酸脱氢酶2（Methylenetetrahydrofolata dehydrogenase 2，MTHFD2）是一碳代谢的关键酶之一，是由人类第二号染色体上基因所编码的线粒体酶，相对分子量约为34kD。最早于1960年，由Scrimgeour等从腹水肿瘤细胞中提取了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性亚甲基四氢叶酸脱氢酶，其活性未被证实。直到1985年Mejia[1]在分化细胞中检测到，并证实其活性，该酶同时具有亚甲基四氢叶酸脱氢酶和环化水解酶的双重活性，对维持细胞生长及活性起到重要作用。其中包括核酸的生物合成、线粒体蛋白的生物合成、甲基化、氨基酸和维生素代谢等。

1 MTHFD2概述

1.1 MTHFD2简介MTHFD2能够将5,10-亚甲基-四氢叶酸(5,10-CH2-THF)转化为5,10-甲酰基-四氢叶酸(5,10-CH-THF)。MTHFD2为有脱氢酶作用，而且还具备5,10-THF环化水解酶活性的双功能蛋白。它由三个功能结合区域组成，但合成酶区域功能丧失，对NAD具有特异性的新型脱氢酶，而对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)不具有特异性[2]。MTHFD2位于线粒体内，需要Mg2+或Mn2+参与激活；无机盐不仅是必须的，而且还作为NADP竞争性抑制[3]。

1.2 MTHFD2在线粒体中的作用 在线粒体内，叶酸经过两次还原后形成重要中间产物四氢叶酸（THF），然后在羟甲基转移酶2（SHMT2）的作用下及丝氨酸和甘氨酸的参与下产生一碳单位和5，10-亚甲基四氢叶酸(CH2-THF)。在哺乳动物中一碳单位主要参与丝氨酸和甘氨酸的代谢过程。通过使用稳定的同位素标记，在一个小鼠胚胎细胞系中，发现细胞质中提供甲基循环的一碳单位超过75%是来源于线粒体[4]。而CH2-THF进一步被MTHFD2转化为5,10-甲基四氢叶酸（CH+-THF)，进一步还原为10-甲酰基四氢叶酸(CHO-THF)。同时CHO-THF在MTHFD1酶的作用下生成甲酸盐，甲盐酸、丝氨酸和甘氨酸可通过线粒体膜转入细胞质中被使用（如图1）。

1.3 MTHFD2在细胞质中的作用 在细胞质中，甲酸盐可转化为10-甲酰基四氢叶酸(CHO-THF),CHO-THF是合成嘌呤的底物。10-甲酰基四氢叶酸可转化为5，10-亚甲基四氢叶酸(CH2-THF)。在胸腺嘧啶合成酶（TYMS）作用下，脱氧尿苷酸（dUM）和5，10-亚甲基四氢叶酸(CH2-THF)可转化成脱氧胸腺嘧啶一磷酸（dTMP）；这些新合成的嘌呤和嘧啶用于维持细胞的增殖。而且CH2-THF还可以转化为CH3-THF，参与DNA甲基化的调节，见图1。

图1 一碳单位代谢示意图

1.4 MTHFD2在细胞核中的作用2015年Nina等[5]还发现该酶定位于细胞核，证实MTHFD2是一个核蛋白，可以促进细胞增殖。并且与DNA复制位点共定位。他们报道了MTHFD2与两个差异明显的基因集共表达，分别代表氨基酸新陈代谢和细胞增殖。单独过表达MTHFD2足以促进细胞增殖，而不需要依赖于脱氢酶活性。

2 MTHFD2的功能及其应用

叶酸代谢在哺乳动物细胞中是独立分开的，主要在细胞质和线粒体之间[6]。最近Woeller等[7]发现，叶酸依赖酶的定位是动态变化的，不同组织、细胞类型和细胞周期之间存在差异。而MTHFD2作为叶酸代谢的关键酶，介导一碳单位新陈代谢用于支持多个生理过程[8]，其中包括生物合成嘌呤和胸腺嘧啶，氨基酸稳态，如甘氨酸，丝氨酸和甲硫氨酸，表型的维持和氧化还原的保护。

2.1 维持氨基酸平衡 在哺乳动物中一碳单位主要参与丝氨酸和甘氨酸的代谢，线粒体中产生甲酸盐是通过MTHFD2和MTHFD1L的连续活性使亚甲基四氢叶酸通过SHMT2生成丝氨酸或甘氨酸。据报道[9]，MTHFD2的缺失会导致小鼠成纤维细胞中甘氨酸缺失。另外，MTHFD2缺陷的纤维母细胞也缺乏甘氨酸，通过线粒体亚甲基四氢叶酸还原酶和环化酶的表达后可以营救甘氨酸缺乏。2018年，Juliane等[10]发现氧化磷脂调节氨基酸新陈代谢，是通过MTHFD2促进内皮细胞中的核苷酸释放完成的。所以，MTHFD2在参与甘氨酸和丝氨酸调节方面具有重要作用。

2.2 参与嘌呤和嘧啶的合成MTHFD2是叶酸代谢合成嘌呤和嘧啶过程中的重要代谢酶，对细胞的生物学活性及生长有重要作用。MTHFD2在快速增殖的恶性肿瘤中过表达，并且被认为参与线粒体中一碳代谢及嘌呤合成，是肿瘤细胞能够快速生长“主开关”。 在神经母细胞瘤中[11]，发现MTHFD2参与嘌呤合成，影响肿瘤发生与发展，可以作为一种新的治疗策略。2016年，Issam等[12]发现当肿瘤细胞快速增长时，促进MTHFD2和丝氨酸的合成，从而增加甲酰单位的产生来合成嘌呤[12]。当肺癌细胞敲除MTHFD2后可影响嘌呤核苷酸合成的通路，从而减少肿瘤的生长[13]。

2.3 细胞表型的维持 叶酸介导的一碳代谢，还可以影响表观遗传和致癌作用，这反映在DNA甲基化和DNA合成中的关键作用，从而导致染色体复制过程中的不稳定，增加基因突变的概率，诱发或促进肿瘤的发生发展。2019年，Green等[14]发现，MTHFD2通过作用于HIF-2αmRNA甲基化，影响肾细胞肾癌新陈代谢重编，促进肿瘤生长。由此可见MTHFD2可以通过甲基化的作用，影响肿瘤的进展。另外还发现MTHFD2不仅局限在线粒体，而且发现定位于细胞核时，并独立于脱氢酶活性支持癌细胞增殖[5,15]，当敲除MTHFD2导致肿瘤细胞的死亡不能被其代谢产物甲酸盐营救[16]。说明该蛋白拥有额外的功能，它的功能展现在细胞核中。因此MTHFD2非酶功能对肿瘤细胞也非常重要。2018年，Costas等[15]通过蛋白互作和功能数据分析发现MTHFD2的另外一个非酶功能，涉及到了RNA加工和翻译。他们发现MTHFD2与核蛋白密切相关，这些蛋白主要涉及RNA新陈代谢和翻译，包括小核糖体亚基和多种不均一核糖核蛋白家族成员。2020年，Yue等[17]发现，MTHFD2可调控DNA修复来维持大鼠干细胞多向分化潜能，主要是在细胞核中通过维持DNA末端剪切功能和促进同源重组修复功能来完成的。所以，这些额外的功能会影响基因的表达和基因的突变，进而影响细胞的表型变化。

2.4 维持细胞内环境的稳态 肿瘤细胞的氧化应激是肿瘤细胞在快速增殖中需要面临的问题之一。NADPH是细胞中重要的抗氧化物质，在肿瘤的发展与转移中扮演着重要的角色。最近一项重要的发现[18]，MTHFD2催化亚甲基四氢叶酸生成甲酰基四氢叶酸，同时产生NADPH。NADPH可以为还原性生物合成和氧化还原防御提供动力的辅助因子。2019年，Ju等[19]还发现MTHFD2在结直肠癌细胞中维持NADPH稳态以及促进肿瘤发展与转移的重要作用，抑制MTHFD2可以显著诱导ROS的上升；在缺氧和悬浮培养条件下，MTHFD2可以维持细胞内氧化还原稳态，抵御失巢凋亡。说明MTHFD2在维持氧化还原稳态中扮演着重要的角色。

3 MTHFD2在恶性肿瘤中的研究进展

代谢的改变在癌症发病机制中的作用早已证实。早在20世纪20年代Otto Warburg[20]观察到肿瘤细胞高效率消耗葡萄糖，甚至在有氧条件下进行糖酵解。20世纪40年代，氨苯喋呤治疗急性淋巴细胞白血病，使得病情首次得到缓解[21]，并证实其作用靶点是参与叶酸代谢的二氢叶酸还原酶(DHFR)。核酸代谢抑制剂吉西他滨被用于胰腺癌、肺癌、膀胱癌的治疗[22]；作用于胸苷酸合成酶的5-氟尿嘧啶和培美曲塞等药物运用于癌症的治疗[23]。由此可见代谢的改变对癌症的发生、发展至关重要。MTHFD2作为一碳代谢的关键酶，在肿瘤中的作用越来越受到关注，故针对MTHFD2在恶性肿瘤中的研究进展概述如下。

3.1 MTHFD2的表达与肿瘤患者临床分期及预后的关系MTHFD2在肿瘤快速生长过程中发挥重要的作用。已经有大量研究证实其在肿瘤组织中呈现高表达，且与疾病的分级分期呈正相关，导致不良的预后。通过检测698例乳腺癌样本组织中MTHFD2的表达情况[24]，发现41.12%的样本组织中高表达MTHFD2，且MTHFD2的表达与肿瘤大小，组织病理分期，淋巴结转移和是否远处转移呈正相关性。MTHFD2在神经胶质瘤[25]、头颈部鳞状细胞癌[26]、食道鳞状细胞癌[27]、肝细胞癌[28]、肾细胞癌[29]中同样高表达，并且与患者预后密切相关，被认为可以作为一个独立的生物标记来预测预后。而MTHFD2与相关基因联合可以提高预测的准确性，如在胰腺癌[30]中，联合MTHFD2和ALDH1L2可以作为独立预后因素评估总体生存率和无病生存率。SHMT2、MTHFD2和ALDH1L2在直肠癌中[31]联合高表达与不良预后的相关性更高。

3.2 MTHFD2作用于恶性肿瘤的相关机制研究癌细胞具有无限增殖的能力，但快速的增殖过程中将不得不面临的问题是能量和营养物质的缺乏。为了维持快速生长，并在营养和氧气匮乏的环境中生存，癌细胞重编新陈代谢来适应细胞的快速增殖。MTHFD2对一碳代谢的影响是非常关键的，但其作用机制错综复杂，不尽相同。以下根据MTHFD2的功能进行分类概述。

MTHFD2在维持氨基酸平衡方面发挥重要作用，在哺乳动物中一碳单位主要参与丝氨酸和甘氨酸的代谢过程中。MTHFD2在乳腺癌细胞[32]代谢重编中主要参与糖酵解、叶酸代谢和甘氨酸与丝氨酸转换，最终导致甘氨酸生物合成受阻，限制癌细胞的生长。另外，乳腺癌细胞敲除MTHFD2后会导致波形蛋白的表达减少，导致肿瘤细胞的迁移能力和侵袭能力受损[33]，而且导致肿瘤干细胞数量的减少[13]。

氧化应激是肿瘤细胞在快速增殖中需要面临的问题之一，MTHFD2在维持细胞内环境的稳态方面发挥重要作用。2019年，Ju等[19]发现，在结肠癌中，MTHFD2通过调控氧化还原稳态促进结肠癌细胞的生长和转移。

2020 年，Chan等[34]发现，抑制MTHFD2可 调节肺癌细胞氧化还原稳态和细胞代谢重编，并且具有抑制肺癌细胞的活力，转化和自我更新的能力。

叶酸介导的一碳代谢，还可以影响表观遗传和致癌，这反映在DNA甲基化和DNA合成中的关键作用，从而导致染色体复制过程中的不稳定，增加基因突变的概率，诱发或促进肿瘤的发生发展。研究发现[35]，在肝细胞癌中观察到MTHFD2 CpG岛启动子区异常甲基化状态。2019年，Green等[14]发现，MTHFD2通过作用于HIF-2αmRNA甲基化，影响肾细胞肾癌新陈代谢重编，促进肿瘤生长。并且发现MTHFD2活性比MTHFD2蛋白数量更重要，这说明线粒体一碳单位活性是细胞增殖的限速关键所在。

随着分子生物学的快速发展，miRNA、LncRNA、cirRNA对MTHFD2的作用机制研究也不断深入，miRNA通过抑制MTHFD2的表达而发挥抗肿瘤作用。如miR-92a[36]、miR-504-3p[37]、miR-33a-5p[38]、miR-940[25]、miRNA-22[39]、hsa-miR-202[40]、miR-9[41]直接下调MTHFD2水平，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞的凋亡，改善了患者的预后。lncRNA TUG1通过抑制MiR-9促进乳腺癌细胞增殖，且正性调节MTHFD2的表达[42]。circ-MTHFD2[43]也可作为临床预测非小细胞肺癌的标记物，在诊断和病理分期及预后方面有明显差异。

3.4 MTHFD2改变肿瘤对药物的敏感性 通过大量的机制研究，目的在于发现治疗肿瘤可能的作用靶点。在MTHFD2作用肿瘤的机制研究中发现，低表达MTHFD2可以增加肿瘤对放化疗的敏感性，从而提高抗癌作用。Kirtikar等[44]发现阻断MTHFD2能改善β拉帕醌化疗和离子放射治疗对头颈部鳞状细胞癌的敏感性。同样的低表达MTHFD2可增加乳腺癌对甲氨蝶呤的敏感性，能恢复肺癌对吉非替尼的敏感性[13]。另外，2019年，Xu等[45]发现低表达circ-MTHFD2的胃癌细胞株对培美曲塞不易耐药。随着研究的不断深入，MTHFD2小分子抑制剂就可能成为治疗肿瘤的新型抗叶酸药物，不但抑制肿瘤生长，还能增强对放化疗的敏感性。

4 总结与展望

叶酸代谢相关的辅酶存在于几乎所有的已知的生物体和各种类型的细胞中。细胞中的一碳循环由叶酸相关辅酶介导，对维持细胞生长及活动起到重要作用，包括核酸、蛋白的生物合成和氨基酸、维生素代谢等。若叶酸缺乏将会导致DNA合成障碍最终影响正常的细胞周期并导致细胞的死亡。MTHFD2是一碳代谢的关键酶之一，它不仅具有亚甲基四氢叶酸脱氢酶和环化水解酶的双重活性，作为细胞核蛋白，还独立参与氨基酸新陈代谢和细胞增殖。正因MTHFD2具有如此重要的功能，所以越来越受到大家的关注，特别是在恶性肿瘤方面的研究与应用，可以作为重要的预测因子和药物靶点。

然而，已知的MTHFD2的代谢功能对癌症的重要作用可能无法作为唯一的解释。如用线粒体通路初级产品甲酸盐补充培养基，未能挽救MTHFD2抑制癌细胞[16,46]；通过抑制SHMT2酶应该阻断线粒体途径，但是并没有引起细胞死亡，除非缺乏甘氨酸[47]；尽管单碳代谢和细胞表型之间不存在明显的联系，但敲除MTHFD2也影响体外侵袭和迁移。综上所述，MTHFD2与肿瘤关系密切，在预测和治疗肿瘤方面具有很大的潜力，可能成为未来治疗肿瘤的重要靶点，具体作用机制有待进一步研究和探索。