子痫前期孕妇胎盘组织中BRCA1、MIC-1的表达情况及临床意义▲

李 洋 郝雅芹 高 倩 李云霞 张 颜

(保定市第二中心医院产科，河北省保定市 072750)

子痫前期的发生率和病死率极高，可影响2%～8%的妊娠妇女，是发展中国家孕产妇死亡的重要原因[1-2]。临床上，常根据临床体征和症状的严重程度将子痫前期分为轻度子痫前期和重度子痫前期，同时可根据临床体征和症状出现的时期将其分为早发型子痫前期(妊娠34周及之前出现)和晚发型子痫前期(妊娠34周之后出现)[3]。目前子痫前期的病因尚不完全清楚，有研究表明子痫前期的潜在发病机制可能是滋养细胞重铸障碍造成了胎盘缺氧，导致多种炎性因子进入母体血液循环，最终引发血管内皮损伤和全身系统炎症反应[4]。巨噬细胞抑制因子-1(macrophage inhibitory cytokine-1，MIC-1)是转化生长因子β超家族成员之一，位于合体滋养细胞和蜕膜，在胎盘功能维持和胚胎发育过程中发挥重要作用，有研究表明在炎症、急性损伤、肿瘤等病理状态下其表达水平增高[5]。而子痫前期会引发全身炎症反应，提示MIC-1可能与子痫前期的发生有关。乳腺癌Ⅰ型易感基因(breast cancer typeⅠ susceptibility gene，BRCA1)是一种抑癌基因，在乳腺癌、卵巢癌等疾病中表达异常[6]，且在调控细胞增殖、DNA修复及诱导损伤细胞凋亡等过程中起关键作用[7]。而胎盘滋养细胞凋亡及侵袭力异常被认为是子痫前期的重要发病机制[4]，由此推测BRCA1可能也参与子痫前期的发病过程。因此，本研究通过检测子痫前期孕妇胎盘中BRCA1、MIC-1的表达情况，探讨二者在子痫前期孕妇中的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年1月至2021年1月在保定市第二中心医院产科经剖宫产分娩的子痫前期孕妇80例，纳入标准：(1)符合第8版《妇产科学》中子痫前期的诊断和分度标准[8]。(2)有剖宫产术指征，且患者及家属同意接受剖宫产术；(3)单胎妊娠；(4)接受子痫前期常规治疗，且分娩出活胎。排除标准：(1)有免疫性疾病、高血压、慢性肝炎、慢性肾炎、糖尿病等疾病；(2)既往有子痫前期史或有家族史；(3)合并其他妊娠并发症；(4)术中发现有胎盘粘连、胎盘植入等导致胎盘滞留超过30 min；(5)临床资料不完整。将80例子痫前期孕妇分为轻度子痫前期组和重度子痫前期组，各40例。轻度子痫前期组孕妇年龄22～33(26.63±4.52)岁，分娩孕周为37～40(38.35±1.33)周，孕前体质指数(22.58±3.25)kg/m2；重度子痫前期组孕妇年龄24～35(26.63±4.52)岁，分娩孕周为37～41(38.13±1.04)周，孕前体质指数(23.20±2.56)kg/m2。另外选取同期因社会因素或头盆不称而在本院行剖宫产的40例正常孕妇为对照组，年龄23～36(26.24±5.35)岁，分娩孕周为37～41(38.12±1.45)周，孕前体质指数(22.01±2.83)kg/m2。3组一般资料差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究经本院医学伦理委员会的批准，所有孕妇均自愿参与本研究并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集：于胎盘娩出后15 min内快速收集组织样本，于胎盘母体面中央取2份体积约为1 cm3的胎盘组织(约2 g)。用PBS快速反复冲洗其中一份组织，直至无血残留，然后放入液氮中快速冷冻，保存于-80 ℃冰箱；用福尔马林固定另一份胎盘组织后，行石蜡包埋。所有操作都尽可能快地在冰桶上进行，尽量减少样品的反复冻融次数。于剖宫产前采集两组孕妇晨起空腹静脉血4 mL，以4 000 r/min离心10 min后取血清(离心半径15 cm)。

1.2.2 生化指标的检测和血压的测量：采用Microlab 300全自动生化分析仪(上海玉研科学仪器有限公司)检测血清总胆固醇、三酰甘油、LDL-C、HDL-C水平及24 h尿蛋白含量。采用电子血压计(OMRON公司，型号：HEM-7012)测量孕妇产前收缩压和舒张压，均于早上9点且孕妇处于安静状态下进行测量。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测胎盘中BRCA1和MIC-1 mRNA表达水平：使用TRIzol试剂(Invitrogen公司，货号：15596026)提取胎盘组织中的总RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司)测定RNA的浓度和纯度。以1 μg总RNA为模板，经16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min等步骤反转录得到cDNA，反转录试剂盒购自北京伊塔生物科技有限公司(货号：YT9036)。使用TaqMan® Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems公司，货号：4369016)，通过实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司，型号：ABI 7500)扩增目的基因。反应体系包括cDNA 4 μL，正向、反向引物各1 μL，TaqMan® Gene Expression Master Mix 10 μL，无RNA酶的灭菌水4 μL。PCR反应条件为94 ℃、 5 min； 94 ℃、 30 s，61 ℃、 30 s，72 ℃、 1 min，共40个循环。以GAPDH为内参基因，所有引物序列均由合肥知恩生物技术有限公司合成。采用2-ΔΔCt法分析BRCA1、MIC-1 mRNA相对表达水平。引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.2.4 免疫组化法检测胎盘组织中BRCA1、MCI-1蛋白表达：将石蜡包埋的胎盘组织常规脱蜡水化，PBS洗涤3次，高温高压修复抗原5 min。自然冷却后，用PBS洗涤胎盘组织，加入一抗BRCA1抗体或MIC-1抗体(上海恒斐生物科技有限公司，货号：ab191042-BRCA1、bs-9676R-2；稀释比例为1 ∶1 000,)室温孵育1 h，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗IgG(北京博尔西科技有限公司，货号：BHR201；稀释比例为1 ∶2 500)室温孵育15 min。DAB染色，苏木精复染、脱水、透明、封片。于400倍光学显微镜下观察，将出现棕色或棕黄色颗粒的细胞判定为阳性细胞。随机选择10个不重复视野，统计阳性细胞数并计算阳性细胞率，阳性细胞率<10%记为阴性表达，若阳性细胞率≥10%但<30%记为弱阳性表达，若阳性细胞率≥30%但<70%记为中等强度阳性表达，若阳性细胞率≥70%记为强阳性表达。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料用(x±s)表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；计数资料以例数(百分比)表示，等级资料的比较采用秩和检验；采用Pearson检验分析BRCA1 mRNA表达水平与MIC-1 mRNA表达水平之间，及BRCA1、MIC-1 mRNA表达水平与临床指标之间的相关性。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组孕妇血压和生化指标的比较 重度子痫前期组和轻度子痫前期组孕妇收缩压、舒张压、平均动脉压、24 h尿蛋白、总胆固醇水平、LDL-C水平较对照组升高，且重度子痫前期组孕妇收缩压、舒张压、平均动脉压、24 h尿蛋白、LDL-C水平均高于轻度子痫前期组孕妇(均P<0.05)；重度子痫前期组和轻度子痫前期组孕妇中HDL-C水平较对照组降低，且重度子痫前期组孕妇HDL-C水平低于轻度子痫前期组孕妇(均P<0.05)。见表2。

表2 3组孕妇血压和生化指标的比较(x±s)

2.2 3组孕妇胎盘组织中BRCA1、MIC-1蛋白表达情况的比较 在BRCA1蛋白阳性表达方面，重度子痫前期组<轻度子痫前期组<对照组(P<0.05)；在MIC-1蛋白阳性表达方面，重度子痫前期组>轻度子痫前期组>对照组(P<0.05)。见表3和图1。

表3 3组孕妇胎盘组织中BRCA1、MIC-1蛋白表达情况的比较(n)

图1 3组胎盘组织中BRCA1、MIC-1蛋白的表达情况(免疫组织化学染色，×400)

2.3 3组孕妇胎盘组织中BRCA1和MIC-1 mRNA表达水平的比较 重度子痫前期组和轻度子痫前期组孕妇胎盘组织中BRCA1 mRNA表达水平低于对照组，且重度子痫前期组低于轻度子痫前期组(均P<0.05)；重度子痫前期组和轻度子痫前期组孕妇胎盘组织中MIC-1 mRNA表达水平高于对照组，且重度子痫前期组高于轻度子痫前期组(均P<0.05)。见表4。

表4 3组孕妇胎盘组织中BRCA1和MIC-1 mRNA相对表达水平的比较(x±s)

2.4 子痫前期孕妇胎盘组织中BRCA1和MIC-1 mRNA表达水平与临床指标的相关性 子痫前期孕妇胎盘组织中BRCA1 mRNA表达水平与收缩压、舒张压、平均动脉压、24 h尿蛋白水平、总胆固醇水平、三酰甘油水平、LDL-C水平呈负相关，与HDL-C水平呈正相关(均P<0.05)；子痫前期孕妇胎盘组织中MIC-1 mRNA表达水平与收缩压、舒张压、平均动脉压、24 h尿蛋白水平、总胆固醇水平、三酰甘油水平、LDL-C水平呈正相关，与HDL-C水平呈负相关(均P<0.05)。见表5。

表5 子痫前期孕妇胎盘组织中BRCA1、MIC-1 mRNA表达水平与临床指标的相关性

2.5 子痫前期孕妇胎盘组织中BRCA1、MIC-1 mRNA表达水平的相关性 子痫前期孕妇胎盘中BRCA1 mRNA、MIC-1 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.436，P<0.001)。

3 讨 论

子痫前期是妊娠20周后发生的一种特发性高血压综合征，表现为多系统损伤，临床表现包括蛋白尿、血小板减少、肾功能不全、肝功能受损、肺水肿等症状[9]。在发展中国家，子痫前期的发生率为4%～18%，病死率高达10%～15%[10]，是死产和婴儿过早死亡的第二大原因[11]，严重威胁母婴的健康和生命安全。相关研究表明，炎症反应、滋养细胞异常凋亡、血流灌注异常等均可能是导致子痫前期发生的主要原因[12]，但具体作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨子痫前期患者胎盘组织中BRCA1、MIC-1的表达情况及临床意义，为子痫前期发病机制的研究提供参考依据。

BRCA1基因定位于人类染色体17q21，所编码的蛋白的相对分子量为220 000[13-14]。研究表明BRCA1可以干扰细胞周期，抑制细胞增殖，促进DNA的损伤修复[15]，在多种肿瘤疾病中发挥重要作用[16]。滋养细胞具有侵袭性强、增长率高等特点，这与肿瘤细胞十分相似[17]，因此我们推测BRCA1可能与子痫前期的发生有关。本研究结果显示，子痫前期孕妇胎盘中BRCA1蛋白及mRNA表达水平较健康孕妇下降(P<0.005)。这提示BRCA1表达水平下降可能与子痫前期的发生有关，原因可能是BRCA1参与胎盘滋养细胞的增殖、侵袭及凋亡的过程，其低表达水平可能引起胎盘血液供应不足，从而导致患者的胎盘功能下降，促进子痫前期的发生和发展。另外，我们还发现子痫前期孕妇胎盘组织中BRCA1 mRNA表达水平与收缩压、舒张压、平均动脉压、24 h尿蛋白水平、总胆固醇水平、三酰甘油、LDL-C水平呈负相关，与HDL-C水平呈正相关，进一步表明了BRCA1的表达水平与子痫前期的发生相关，或可作为诊断子痫前期的潜在指标。

MIC-1又称为生长分化因子-15，在除胎盘和前列腺外的大多数正常组织中表达较低[18]，但其在肿瘤、炎症发生时大量表达，广泛参与细胞凋亡、分化、增殖及机体炎症反应信号传递[19]。本研究中子痫前期孕妇胎盘组织中MIC-1蛋白及mRNA表达水平高于健康孕妇，且MIC-1 mRNA表达水平与收缩压、舒张压、平均动脉压、24 h尿蛋白、总胆固醇、三酰甘油水平、LDL-C水平呈正相关，与HDL-C水平呈负相关，提示其与子痫前期的发生有关，推测MIC-1可能通过参与胎盘滋养细胞的凋亡过程导致子痫前期的发生。本研究结果还提示子痫前期患者胎盘组织中BRCA1 mRNA与MIC-1 mRNA表达水平呈明显负相关，但二者的关联机制尚不清楚，有待进一步探究。

综上所述，子痫前期孕妇胎盘中BRCA1呈低表达而MIC-1呈高表达，两者可能共同参与子痫前期的发生，有可能成为治疗子痫前期的新靶点。