STAT3/iNOS通路在慢性阻塞性肺疾病伴气道重塑中的作用▲

乔 迪 胡 赤 吴 珏 李秋艳 吴 涛 樊 君

(1 昆明同仁医院呼吸内科，云南省昆明市 650228； 2 中国人民解放军联勤保障部队第920医院心血管内科，云南省昆明市 650024 )

随着社会工业化和人口老龄化的加剧，慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的患病率显著上升，其已成为全球最主要的死亡病因之一，也是我国第三大死亡病因[1]。由于气道和肺部长期受到有害颗粒或气体的刺激，肺部及支气管中异常炎症反应增强，这最终导致COPD的发生，严重者可危及生命[2]。其中，卷烟烟雾中的有害颗粒和气体是引起COPD的主要危险因素[3]。信号传导子及转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)/诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)信号通路可调控多种生物进程[4]，其中iNOS作为STAT3的下游因子，可进一步促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平升高，引起气道壁增厚，进而导致气道重塑，引起COPD的发生[5]。有学者发现，补肺益肾方可能够通过抑制STAT3的磷酸化，从而改善COPD[6]。而iNOS是治疗严重肺气肿和肺动脉高压的潜在新靶点之一[7]。但是，STAT3/iNOS通路在COPD气道重塑中的作用机制如何，相关研究较少。本研究构建COPD大鼠模型，并使用STAT3特异性抑制剂Stattic进行干预，同时使用含3.0%香烟烟雾提取物的细胞培养基诱导支气管上皮细胞，构建体外细胞模型，并沉默细胞STAT3的表达，检测动物模型和细胞模型中相关炎性因子的表达水平，探讨STAT3/iNOS通路在COPD伴气道重塑中的作用，以期为COPD伴气道重塑患者的临床治疗提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 实验动物 40只无特定病原体级雄性Wistar大鼠购自成都达硕实验动物有限公司[许可证号：SCXK(川)2019-028]，体质量200～210 g，6～7周龄，置于温度为(20±2)℃、湿度为50%～60%、12 h光暗循环的环境中喂养，自由饮水、进食。本研究动物实验的开展符合国家实验室动物伦理保护标准及相关法律规定，按照3R原则给予实验动物人道的关怀照顾。

1.2 实验细胞、主要试剂和仪器 大鼠支气管上皮细胞购自ATCC细胞库。STAT3特异性抑制剂Stattic(Medchem Express公司；规格：100 mg；批号：M00248)，醋酸地塞米松片(浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H33020822)，红塔山牌香烟(焦油含量11 mg/支、一氧化碳含量11 mg/支、烟碱含量1.1 mg/支；红塔集团玉溪卷烟厂，批号：210104)，RNA小干扰阴性对照载体质粒(si-NC)及RNA干扰STAT3载体质粒(si-STAT3)由生工生物工程(上海)股份有限公司构建，瑞氏-姬姆萨染色试剂盒(北京西华仪器科技有限公司，批号：M382537)，大鼠分泌型IgA(secretory IgA，SIgA)、分泌成分(secretory component，SC)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)ELISA试剂盒(上海润裕生物科技有限公司，批号：ry010580、ry063287、ry064258、ry076305)；十二烷基硫酸钠、脂多糖、Lipofectamine 2000转染试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒(美国Sigma Aldrich Lab & Production Materials公司，批号：L3771、SMB00704、NPT01、11483188001、QR0100)，RNA提取试剂盒、蛋白提取试剂盒、ECL显色试剂盒和二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司，批号：RCH003、ZLI-9018、36208ES60、K-PRTD2FS)，4%多聚甲醛(武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：G1101)，胎牛血清、DMEM和HE染色试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，批号：E510002、E600008、E607318]，STAT3、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3，p-STAT3)、iNOS、GAPDH兔单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(Abcam公司，批号：ab32500、ab76315、ab178945、ab181602、ab133470)。尼康SMZ745光学显微镜(上海普赫生物科技有限公司)，FLUOstar Omega型全自动多功能酶标仪(BMG LABTECH公司)，全能型凝胶成像分析系统ChemiDoc-MP(山东三瑞科技有限公司)，石蜡切片机(湖北惠达仪器有限公司)，自制熏烟箱(规格：50 cm×50 cm×50 cm)，SNH-Ⅲ型真空抽气泵(上海将来实验设备有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 COPD大鼠模型的构建与分组：将40只大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、STAT3抑制剂组、阳性对照组，每组10只。除对照组外，其余各组大鼠采用气管滴注脂多糖加烟熏法[8]构建COPD大鼠模型。在实验的第1天和第15天，向各组大鼠气管内注入浓度为1 g/mL的脂多糖溶液0.2 mL；在实验的第2～14天和第16～28天在烟熏箱中点燃12支香烟(燃烧30 min)，使烟熏箱内的烟雾浓度达到实验要求，然后将各组大鼠放入自制烟熏箱中，30 min/次，2次/d，两次需间隔2 h。从实验的第29天开始，给予STAT3抑制剂组大鼠尾静脉注射500 μg/kg的STAT3特异性抑制剂Stattic[9]，每7 d注射1次；给予阳性对照组大鼠按10 mL/kg灌胃醋酸地塞米松溶液(称取10.7 μg醋酸地塞米松片，使用10 mL生理盐水溶解)[10]，1次/d；对照组和模型组按10 mL/kg灌胃生理盐水，1次/d。4组连续干预28 d。

1.3.2 支气管上皮细胞的培养与分组：(1)参照陈翠芬等[11]的方法制备香烟烟雾提取物。使用真空抽气泵将燃烧的20支香烟烟雾吸到含DMEM的细胞培养瓶中，剧烈晃动培养瓶，使烟雾充分溶解，呈咖啡样色；用氢氧化钠将含有烟雾的溶液的pH值调整为7.4左右，再用0.45 μm过滤器(杭州凯英仪器经营部，型号：13 mm×0.45 μm)过滤烟雾溶液，所得溶液即为香烟烟雾提取物原液，使用DMEM将香烟烟雾提取物原液稀释至所需浓度待用。(2)使用含10% 胎牛血清的DMEM培养大鼠支气管上皮细胞，并将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行传代培养，细胞融合度达75%时，将细胞密度调整为1×106个/mL，接种至6孔板中，2 mL/孔，然后将细胞随机为正常组、模型组、si-NC组、si-STAT3组，每组设置6个复孔，使用Lipofectamine 2000试剂盒将载体质粒si-NC转染si-NC组细胞、载体质粒si-STAT3转染si-STAT3组，模型组和正常组细胞不给予干预。转染24 h后，根据相关文献[11]及前期预实验结果，使用含3.0%香烟烟雾提取物的DMEM培养模型组、si-NC组和si-STAT3组的细胞，使用DMEM培养正常组细胞，各组均置于37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.4 观察指标

1.4.1 计数大鼠肺泡灌洗液中白细胞数量及其他分类细胞比例：末次给药结束后，即刻通过腹腔注射3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉4组大鼠，开胸分离大鼠气管、支气管、肺组织，结扎主支气管，于4 ℃条件下，用连接注射器的灌洗器通过左、右侧支气管分别向左、右侧肺叶中注入2 mL生理盐水，缓慢抽吸3次，负压吸出，收集各组大鼠肺泡灌洗液，4 ℃下3 000 r/min离心10 min，收集沉淀，使用200 μL PBS溶液重悬，制成20 μL悬液。参照黄莉容等[12]的方法，首先在光学显微镜下进行白细胞计数，然后使用瑞氏-姬姆萨染色试剂盒对样本进行染色，进行细胞分类计数，在光学显微镜下统计200个细胞中其他分类细胞所占比例，其他分类细胞包括单核巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。其中，单核巨噬细胞的细胞质染成灰蓝色，细胞核呈马蹄形并染成紫蓝色；淋巴细胞呈圆形，细胞核致密并染成深紫色；中性粒细胞的细胞核呈分叶状并染成紫蓝色，细胞质几乎无色；嗜酸性粒细胞体积略大，细胞核呈紫色，细胞质呈红色。

1.4.2 观察大鼠肺组织病理学变化：灌洗结束后，对大鼠实施安乐死，取出大鼠肺组织，将右肺迅速置于-80 ℃冰箱用于后续实验，将左肺迅速置于4%多聚甲醛中固定。取固定24 h后的左肺组织行石蜡包埋，使用切片机制成厚度为4 μm的切片，然后严格按照HE染色试剂盒说明书，依次进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、苏木素染色、分化液分化、伊红染色、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固等操作，将封固后的切片在室温下晾干，于光学显微镜下观察肺组织病理学变化。

1.4.3 测量大鼠支气管管壁面积及支气管平滑肌厚度：取1.4.2中各组大鼠肺组织切片，于400倍光学显微镜下，挑选出有完整横断面的中小支气管，采用Image J软件测定支气管平滑肌面积、支气管管腔内周长、支气管壁面积，计算支气管平滑肌厚度，支气管平滑肌厚度=支气管平滑肌面积/支气管管腔内周长。

1.4.4 检测大鼠肺组织中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量：取1.4.2中置于-80 ℃冰箱的大鼠部分肺组织，严格按照 ELISA试剂盒说明书，使用全自动多功能酶标仪检测肺组织中的SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量。

1.4.5 检测大鼠肺组织中STAT3和iNOS蛋白表达水平：取1.4.2中置于-80 ℃冰箱的剩余肺组织，使用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，采用二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，将蛋白煮沸后进行SDS-PAGE，再将蛋白转至PVDF膜，采用5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜2 h，PBS洗膜4次，10 min/次，然后加入稀释后的p-STAT3(稀释比为1 ∶2 000)、STAT3(稀释比为1 ∶2 000)、iNOS(稀释比为1 ∶2 000)和GAPDH兔单克隆抗体(稀释比为1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜，PBS洗膜4次，10 min/次，使用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(稀释比为1 ∶5 000)室温孵育PVDF膜2 h，PBS洗膜4次，10 min/次，用ECL显色试剂盒显色。以GAPDH为内参，采用全能型凝胶成像分析系统分析目的蛋白的相对表达水平。

1.4.6 检测各组细胞的白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、STAT3、iNOS mRNA表达水平：使用RNA提取试剂盒提取各组细胞的总RNA，使用分光光度计检测RNA浓度，用无RNA酶的双蒸水定量RNA后使用反转录试剂盒将RNA合成cDNA。以cDNA为模板，按照说明书配置PCR的反应体系，包括2×SYBR Green Real-Time PCR Master Mix 10 μL、cDNA模板1 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL，共20 μL。设置反应程序为95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 10 s，循环40次。以GAPDH为内参，根据2-ΔΔCt法，计算各组细胞白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、STAT3、iNOS mRNA的相对表达水平。各引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey′s检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组大鼠肺泡灌洗液中白细胞计数及其他分类细胞比例 与对照组相比，模型组大鼠肺泡灌洗液中白细胞计数及淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞比例均升高，而单核巨噬细胞比例降低(均P<0.05)；与模型组相比，STAT3抑制剂组和阳性对照组大鼠肺泡灌洗液中白细胞计数及淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞比例均降低，而单核巨噬细胞比例升高(均P<0.05)；STAT3抑制剂组和阳性对照组大鼠肺泡灌洗液中白细胞计数及其他分类细胞比例差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 4组大鼠肺泡灌洗液中白细胞计数及其他分类细胞比例的比较(x±s)

2.2 4组大鼠肺组织的病理学变化 对照组大鼠的肺组织结构正常，上皮结构完整，无明显炎性细胞浸润；模型组大鼠的肺组织出现大量炎性细胞浸润，肺泡结构紊乱，上皮细胞脱落，肺泡腔不规则扩张；STAT3抑制剂组与阳性对照组大鼠的肺组织炎性细胞浸润明显减少，上皮细胞脱落有所改善，肺泡腔较为规则，两组肺组织病理学变化差异不明显。见图1。

图1 各组大鼠的肺组织病理学改变(HE染色，×200)

2.3 4组大鼠支气管壁面积及支气管平滑肌厚度的比较 与对照组相比，模型组大鼠支气管壁面积及支气管平滑肌厚度均增加(均P<0.05)；与模型组相比，STAT3抑制剂组和阳性对照组大鼠支气管壁面积及支气管平滑肌厚度均减小(均P<0.05)；STAT3抑制剂组和阳性对照组大鼠支气管壁面积及支气管平滑肌厚度差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 4组大鼠支气管壁面积及支气管平滑肌厚度的比较(x±s)

2.4 4组大鼠肺组织中的SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量的比较 与对照组相比，模型组大鼠肺组织中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量均升高(均P<0.05)；与模型组相比，STAT3抑制剂组和阳性对照组大鼠肺组织中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量均降低(均P<0.05)；STAT3抑制剂组和阳性对照组大鼠肺组织中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表4。

表4 4组大鼠肺组织中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量的比较(x±s)

2.5 4组大鼠肺组织中STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白表达水平的比较 与对照组相比，模型组大鼠肺组织中STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白表达水平均升高(均P<0.05)；与模型组相比，STAT3抑制剂组和阳性对照组大鼠肺组织中STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白表达水平均降低(均P<0.05)；STAT3抑制剂组和阳性对照组大鼠肺组织中STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。见图2和表5。

表5 4组大鼠肺组织中的STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白相对表达水平比较(x±s)

图2 4组大鼠肺组织中STAT3、p-STAT3、iNOS蛋白表达的Western blot图

2.6 4组细胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表达水平的比较 与正常组比较，模型组和si-NC组大鼠支气管上皮细胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表达水平均升高(均P<0.05)；与模型组和si-NC组比较，si-STAT3组大鼠支气管上皮细胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表达水平均降低(均P<0.05)。见表6。

表6 4组细胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

随着雾霾等环境污染问题日益严重，COPD的患病率和病死率居高不下，对公众健康造成严重威胁，全球每年约有300万人死于COPD，而在中国COPD的总病死率位居第三位[13]。因此，预防和治疗COPD尤为重要。COPD是一种慢性炎症性疾病，主要影响气道及肺脏，可引发多种并发症，包括心血管疾病、肺癌、骨质疏松、焦虑症等[14]。气道重塑是COPD持续发展的关键因素，其病理基础包括上皮细胞损伤、炎性因子浸润、支气管壁面积及支气管平滑肌厚度增加等。Vasilescu等[15]发现，COPD患者的支气管壁面积和支气管厚度显著增加，发生气道重塑，而长期气道重塑可进一步导致支气管哮喘等其他肺部并发症的发生。本研究通过使用气管滴注脂多糖加烟熏法构建COPD大鼠模型，发现大鼠肺组织出现大量炎性细胞浸润，肺泡结构紊乱，上皮组织脱落，肺泡腔不规则扩张，支气管壁面积及支气管平滑肌厚度均增加，这提示COPD大鼠模型构建成功，且大鼠已发生气道重塑。

COPD的炎症反应主要涉及中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞[16]，同时，气道上皮细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞也参与这一过程，而炎症反应的关键环节是中性粒细胞的激活及聚集，且伴随SIgA、SC、TGF-β1含量的升高[17]。其中，TGF-β1是气道炎症发展成气道重塑的关键因子；SIgA可作为呼吸道疾病的评估指标，当病原体侵入和气道炎症发生时，其含量持续升高[18]；而SC与其配体IgA结合后形成SIgA；VEGF水平升高，可使气道壁增厚，进而引起COPD的发生[5]。此外，有研究表明，STAT3/iNOS信号通路参与细胞氧化应激和炎症反应[19]。本研究结果显示，COPD伴气道重塑大鼠肺泡灌洗液中的白细胞计数及淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞比例增加，而单核巨噬细胞比例降低，且肺组织中的SIgA、SC、TGF-β1、VEGF含量，以及STAT3磷酸化水平、iNOS蛋白表达水平均升高(均P<0.05)。这提示COPD伴气道重塑大鼠的肺组织出现炎症反应，同时STAT3/iNOS信号通路处于激活状态。

有学者发现，运动能够抑制烟雾诱发的气道上皮细胞和支气管周围白细胞数量增加及磷酸化STAT3表达上调[20]；甘草、苦参、椴素草本联合治疗能够通过影响COPD小鼠模型中STAT3信号通路，抑制中性粒细胞引起的肺部炎症，降低肺部炎性细胞浸润及iNOS表达水平，从而发挥治疗气管炎症性疾病的作用[21-22]。以上研究表明，抑制STAT3或iNOS的表达，有助于控制呼吸系统炎症，结合COPD伴气道重塑时STAT3/iNOS信号通路处于激活状态的这一结果，我们推测抑制STAT3/iNOS信号通路的表达或可缓解COPD伴气道重塑的相关表现。本研究采用STAT3特异性抑制剂Stattic干预COPD伴气道重塑大鼠，结果显示Stattic干预可改善COPD伴气道重塑大鼠的肺组织病理学变化，降低其肺泡灌洗液中白细胞计数及淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞比例，并提高单核巨噬细胞比例，减小支气管壁面积及支气管平滑肌厚度，下调肺组织中SIgA、SC、TGF-β1、VEGF含量，STAT3磷酸化水平，以及iNOS蛋白表达水平，这提示抑制STAT3/iNOS信号通路的活性可降低COPD大鼠肺组织的炎症反应，并改善其气道重塑。

为进一步观察STAT3/iNOS信号通路在香烟烟雾诱导的COPD伴气道重塑中的作用，本研究采用干扰技术沉默大鼠支气管上皮细胞STAT3的表达，结果显示，经3.0% 香烟烟雾提取物诱导后，大鼠支气管上皮细胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表达水平均升高(均P<0.05)，这提示香烟烟雾可诱导大鼠支气管上皮细胞产生炎症反应，且STAT3/iNOS信号通路可能处于激活状态；而沉默STAT3表达后，大鼠支气管上皮细胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表达水平均降低(均P<0.05)。结合动物实验与细胞实验的结果，我们认为STAT3/iNOS信号通路可能参与香烟烟雾诱导的COPD伴气道重塑及炎症反应，而抑制STAT3/iNOS信号通路的活性可以减轻COPD伴气道重塑大鼠肺组织的炎症反应，改善气道重塑。

综上所述，在香烟烟雾诱导的COPD伴气道重塑中STAT3/iNOS信号通路处于激活状态，而抑制该通路的激活可减轻肺组织和支气管上皮细胞的炎症反应，改善气道重塑，这或可为COPD伴气道重塑的治疗提供新的靶点。但是STAT3/iNOS信号通路在COPD伴气道重塑中的作用机制较为复杂，尚需进一步研究。