浙江引种显齿蛇葡萄二氢杨梅素提取工艺优化及含量分析

黄旭波，秦玉川，刘本同，王丽玲，童晓青，方茹，王衍彬

（浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023）

藤茶，又被称为莓茶、叶茅茶、雪茶、山甜茶等，是由葡萄科Vitaceae 蛇葡萄属Ampelopsis植物显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata的嫩叶加工而成的茶饮。显齿蛇葡萄主要分布于我国的广西、贵州、湖南等省[1]，在瑶族、壮族、土家族等少数民族地区有着广泛的食用和药用历史[2]，其味甘性凉，具有清热解毒，祛风湿，强筋骨等功效，常被用于治疗感冒发烧以及咽喉肿痛等症状[3-4]。显齿蛇葡萄叶富含黄酮、多酚、多糖、维生素等成分，其中以黄酮类，特别是二氢杨梅素（Dihydromyricetin）含量最高，其提取物具有抗氧化、增强免疫、抗炎抑菌、降三高、护肝和抗肿瘤等功效[5-9]。二氢杨梅素是一种双氢黄酮醇类化合物，又被称为双氢杨梅素、双氢杨梅皮素等，广泛存在于葡萄科植物中，在杨梅科Myricaceae、杜鹃花科Ericaceae、橄榄科Burseraceae、豆科Fabaceae 等植物中也有发现。二氢杨梅素在显齿蛇葡萄叶片中的含量非常高，可以达到干质量的20%以上[10]。研究表明，二氢杨梅素具有抗氧化、抗肿瘤、降血压、降血糖和抑制血栓形成等功效[11-12]。

近年来，随着《浙江省林下经济“十四五”发展规划纲要（2021—2025）》[13]的推进，藤茶被引种到浙江省木本粮油（油茶Camellia oleifera、香榧Torreya grandis‘Merrillii’等）经济林下作为林下经济资源进行种植。随着浙江省木本粮油基地建设的不断兴起，藤茶的种植面积不断增加，不仅解决了山地林下土壤裸露、水土流失和林地水分蒸发的问题，而且有助于林农增收和经济林产业的可持续发展。但是鉴于浙江省境内尚未发现有显齿蛇葡萄的野生分布，而藤茶评价研究多以异地或本地收集样品为研究对象，未发现异地野生资源本地栽种评价的相关研究。

自2015 年起，我们将广西、湖北和贵州三地的野生显齿蛇葡萄引种至浙江进行栽培试验，并以藤茶中重要的特征性成分二氢杨梅素含量为指标对资源进行评价，避免了先评价产品后引进资源最终不适宜本地推广栽种的弊端，为藤茶的引种、栽培与产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验原料

研究材料为广西、贵州、湖北的野生显齿蛇葡萄叶片，以及这3 种野生显齿蛇葡萄引种浙江后第5 年的实生叶片（2015 年3 月在广西、贵州、湖北三地进行采样的同时，从3 地引种采样的4 个种质实生种源，引种在浙江省杭州市午潮山林场），样品与采样地点情况见表1。除采自湖北省恩施市来凤县三湖乡的大叶（长6～ 9 cm，宽4～ 5 cm）样品外，其余均为小叶（长3～ 5 cm，宽2～ 3 cm）样品。

表1 采样地点与时间Tab.1 Sampling location and time

1.2 设备与试剂

GZX-9140MBE 鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司；DFT-150 粉碎机，温州顶历医疗器械有限公司；SY-1000E 恒温超声提取器，北京弘祥隆生物技术股份有限公司；RE-5205 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；AL204-IC 电子天平，梅特勒托利多集团；U3000 高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技有限公司；明澈-D 高纯水机，默克有限公司。

二氢杨梅素标样，纯度98%，购自北京世纪奥科生物技术有限公司。甲醇、乙醇、丙酮均为分析纯；磷酸、甲醇、乙醇、乙腈均为色谱纯。

1.3 样品采集与处理

嫩叶指春季采摘叶龄15 d 左右的显齿蛇葡萄叶片；老叶指春季发芽，秋季采摘的显齿蛇葡萄叶片。

2015 年3 月，采摘广西、贵州、湖北三地野生显齿蛇葡萄嫩叶，在采样地晾干，然后于实验室烘箱中35℃烘干。2020 年3 月和10 月分两次采摘引种栽培的3 个种源4 个种质显齿蛇葡萄嫩叶和老叶，与野生样品同样处理。干燥后的样品于粉碎机中粉碎至60 目，备用。

1.4 二氢杨梅素提取方法

根据二氢杨梅素的特性和陈玉琼的研究结果[14]，采用水和乙醇的混合溶液作为提取溶剂，并分别考察了提取温度、水醇比例和超声时间对显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素提取率的影响，根据预试验结果，选择75%（体积分数）乙醇水溶液和40 ℃作为超声提取的萃取溶剂和萃取温度条件。

精确称取粉碎好的显齿蛇葡萄叶样品1.000 0 g，加入20 mL 75%乙醇水溶液，20 kHz 频率，500 W 功率超声萃取25 min，过滤，滤渣重复提取3 次，收集滤液，于旋转蒸发仪中浓缩，再用乙醇定容至100 mL 容量瓶中，0.22 μm 膜过滤，进行HPLC 分析。

1.5 色谱分析方法

1.5.1 色谱条件 Agilent Extend-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温35℃，紫外波长292 nm，流动相比例A（甲醇）∶B（0.1%磷酸水溶液）=25∶75（体积比），进样量10 μL，流速1.0 mL·min-1，等度洗脱。

1.5.2 标准曲线绘制 精确称取二氢杨梅素100.0 mg，用色谱纯乙醇溶解，定容至25 mL 容量瓶中，配制成浓度4.0 mg·mL-1标准溶液，并以此为母液，用乙醇梯度稀释配制成0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1、3.2 mg·mL-1和4.0 mg·mL-1浓度的标准溶液，0.22 μm 膜过滤，进行HPLC 分析。以进样的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

1.5.3 精密度试验 取0.8 mg·mL-1标准样品溶液，按照1.5.1 方法进行进样分析6 次，根据二氢杨梅素的吸收峰面积计算精密度。

1.5.4 稳定性试验 取显齿蛇葡萄叶萃取液样品1 份，分别在0、4、8、16、24、48 h 时进行分析，测定二氢杨梅素含量，以峰面积计算稳定性。

1.5.5 重复性试验 称取同一样品6 份，按照1.4 方法制备样品，按1.5.1 方法进行液相色谱分析，进行重复性试验，按照峰面积计算重复性。

1.5.6 回收率试验 取已测定的样品6 份，按照样品中二氢杨梅素含量的0.8 倍、1.0 倍和1.2 倍加入对照品，按照1.4 方法制备样品，按照1.5.1 方法进行液相色谱分析，根据公式（1）计算加标回收率。

式中，P为加标回收率；m1为试样中的二氢杨梅素含量，单位mg；m2为加标试样中的二氢杨梅素含量，单位mg；m为加标量，单位mg。

1.5.7 二氢杨梅素含量计算 获得样品中二氢杨梅素HPLC 检测峰面积，根据1.5.2 中获得的二氢杨梅素标准样品浓度与峰面积回归方程，获得样品浓度，根据下式（2）计算样品中的二氢杨梅素含量。

式中，C为样品中的二氢杨梅素含量，单位mg·g-1；ω为测试样品中的二氢杨梅素浓度，单位mg·mL-1；v为测试样品定容体积，单位mL；m为样品质量，单位g。

1.6 数据处理

数据整理、平均数、标准差等计算采用WPS 2019，显著性分析和制图采用Origin 2019。

2 结果与分析

2.1 方法学结果

图1 为液相色谱测定二氢杨梅素的标准曲线，其拟合方程为：y=218.74x，R2＝0.999 7，表明在0.20～ 4.0 mg·mL-1浓度范围内线性关系良好。图2 为二氢杨梅素标样和显齿蛇葡萄叶萃取样品的HPLC 色谱图。根据1.5.3～ 1.5.5 方法进行精密度、稳定性和重复性试验，仪器分析精密度RSD=0.17%，重复性试验RSD=0.83%，稳定性试验RSD=1.15%，表明本仪器分析方法的精度可以满足试验的要求，且供试样品溶液在48 h 内是稳定的。

图1 HPLC 测定二氢杨梅素标准曲线Fig.1 Standard curve of Dihydromyricetin by HPLC

图2 二氢杨梅素标样（上）和藤茶样品（下）HPLC 检测图Fig.2 Standard Dihydromyricetin curve (top) and that of samples by HPLC(bottom)

表2 为本方法加样回收率试验结果。从表中可以看出，加样回收率为97.71%～ 101.34%，平均加样回收率为98.88%，RSD=1.42%。由方法学结果表明，本研究建立的提取与分析方法可以满足显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素定量分析的要求。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 The results of standard recovery rate

2.2 萃取方法的研究结果

2.2.1 乙醇浓度对二氢杨梅素萃取得率的影响 二氢杨梅素，分子式为C15H12O8，相对分子质量为320.25，其化学结构式如图3，微溶于冷水和乙酸乙酯，易溶于甲醇、乙醇和丙酮，不溶于氯仿和石油醚。根据二氢杨梅素的溶解特性，摒弃毒性较大的甲醇和丙酮，分别用不同浓度的水醇混合溶液作为提取溶剂，考察其提取得率。

图3 二氢杨梅素化学结构式Fig.3 Structural formula of Dihydromyricetin

图4 为不同乙醇浓度萃取显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素的结果图。其萃取条件为：温度50 ℃，液料比20∶1，萃取时间25 min，振荡浸提。从图中可以看出，二氢杨梅素提取率先随乙醇浓度的增加而增加，达最高点后降低，萃取效果最优的比例是水∶乙醇＝25∶75，在此条件下二氢杨梅素的提取得率可以达到16.21%。

图4 乙醇浓度对二氢杨梅素萃取得率的影响(n=3)Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction yield of Dihydromyricetin（n=3）

2.2.2 萃取温度和超声次数对二氢杨梅素得率的影响 采用液料比20∶1，萃取溶剂水∶乙醇＝25∶75，以25 min 为一个萃取时间段，超声条件为：频率20 kHz，功率500 W，考察不同温度和超声次数对显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素萃取得率的影响。从图5 可看出，在不施加超声的情况下，温度对提取得率的影响较大，提取得率随着温度的上升而提高，在70～ 80 ℃时达到最大，达19.42%。但有研究表明[16]，提取温度超过90℃以后，二氢杨梅素的萃取得率反而降低，这可能是因为热敏性的二氢杨梅素受高温破坏而造成的。超声波辅助萃取显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素效果好于普通萃取，3 次超声萃取效果好于1 次超声萃取，在1次超声萃取时，随着温度的升高，萃取得率也随之提高，而在3 次超声萃取时，温度升高对萃取得率的影响较小，说明3 次萃取已经基本上可以将显齿蛇葡萄叶中的二氢杨梅素萃取干净，其最高萃取得率达30.66%。因考虑到温度可能会对二氢杨梅素的稳定性造成影响，所以本试验选择最适的萃取条件为：液料比20∶1，萃取溶剂水∶乙醇＝25∶75，萃取温度40 ℃，频率20 kHz、功率500 W 条件下超声萃取3 次，每次25 min。

图5 温度和超声萃取次数对显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素萃取得率的影响 (n=3)Fig.5 Effect of temperature and ultrasonic times on extraction yield of dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata leaves（n=3）

2.3 引种显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素含量比较

图6 为广西、贵州、湖北3 个地区4 种显齿蛇葡萄叶野生嫩叶样品及浙江引种栽培5 年后的实生显齿蛇葡萄嫩叶样品中二氢杨梅素的含量比较。从图中可以看出，3 个地区的普通野生显齿蛇葡萄叶样品及引种至浙江的样品中，二氢杨梅素含量都比较高，均超过200 mg·g-1，其中二氢杨梅素含量最高的是采自湖北省恩施市来凤县三胡乡的引种样品，含量高达291.87 mg·g-1。来自湖北的大叶显齿蛇葡萄，叶片大，产量高，但叶片中的二氢杨梅素含量最低，野生样品与栽培样品中的含量均未超过70 mg·g-1。

从图6 中可以得出，引种的4 个种质显齿蛇葡萄嫩叶样品中，栽培样品与野生样品中的二氢杨梅素含量相近。其中，从广西、贵州两地引种的样品中，野生样品二氢杨梅素含量略高于与引种栽培样品，从湖北恩施引种的普通样品与大叶样品中，野生样品中的二氢杨梅素含量略低于引种栽培样品，但均无显著性差异（P＞0.1）。

图6 引种与野生嫩叶样品二氢杨梅素含量比较 (n=5)Fig.6 Dihydromyricetin content from local wild and introduced young leaves(n=5)

3 个种源的小叶样品中，湖北样品的二氢杨梅素含量最高，其次为贵州样品和广西样品，但湖北样品与贵州样品、贵州样品与广西样品的二氢杨梅素含量，并无显著性差异（P＞0.1），湖北种源的栽培样品与广西种源的栽培样品二氢杨梅素含量存在显著性差异（P＜0.05）。从图中6 可以明显看出，采自湖北的大叶样品，其二氢杨梅素含量远低于其它3 个小叶种源样品，并存在极显著性差异（P＜0.01），引种至浙江栽培的湖北大叶样品，亦存在同样规律。

2.4 显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素含量的比较

图7 为3 个种源4 份种质的显齿蛇葡萄老叶与嫩叶中二氢杨梅素含量比较图。从图中可以明显看出，显齿蛇葡萄老叶和嫩叶中的二氢杨梅素含量存在极显著差异，嫩叶中的二氢杨梅素含量均高于老叶，且差异极显著（P＜0.01），其中贵州引种样品老叶与嫩叶中的含量差异最大，嫩叶中的二氢杨梅素含量是老叶的2.07 倍，其次是广西种源、湖北大叶种源和湖北种源，嫩叶中的二氢杨梅素含量分别为老叶的1.58 倍、1.53 倍和1.25 倍。陈玉琼[15]研究也表明，显齿蛇葡萄在生长过程中，随着叶片的老化，其二氢杨梅素的含量随之降低。上述研究表明，显齿蛇葡萄在叶片采摘加工成藤茶时，应该尽量采摘嫩叶，以保证产品中二氢杨梅素的含量。

图7 3个种源4份种质显齿蛇葡萄老嫩叶二氢杨梅素含量比较（n=5）Fig.7 Dihydromyricet in content from introduced A.grossedentata leaves collected in March and October（n=5）

3 讨论与结论

天然植物应用于人类的保健与医疗已有几千年的历史，植物体内存在的天然活性成分，包括黄酮、多酚、多糖、生物碱等，具有多种生理功能[16-17]，是天然植物体在生长过程中所产生的次生代谢产物，也是中药学发展的物质基础[18]，是现代保健食品和药物开发的重要目标之一。由显齿蛇葡萄嫩叶制成的藤茶，因其次生代谢产物二氢杨梅素含量高，并具有多种生理活性功能而备受关注，国内外进行了许多萃取、纯化和生理功能方面的研究[19-20]，市场需求也在急剧扩大。

由于浙江省并无显齿蛇葡萄的天然分布[21]，2015 年将其从广西、湖北和贵州三地引种至浙江省杭州市西湖区、金华市武义县、绍兴市嵊州市、衢州市衢江区、丽水市青田县等地栽培研究，以丰富省内经济作物种类，选育适合浙江生长的显齿蛇葡萄品种。为探索浙江省外野生资源与省内引种资源叶片中二氢杨梅素含量的差异，以及引种资源老叶和嫩叶中二氢杨梅素含量的差异，进行了显齿蛇葡萄叶片中二氢杨梅素提取方法、HPLC 检测方法的研究，获得显齿蛇葡萄叶片中二氢杨梅素的最佳萃取条件——液料比20∶1，萃取溶剂水∶乙醇＝25∶75，萃取温度40 ℃，频率20 kHz、功率500 W 条件下超声萃取3 次，每次25 min；二氢杨梅素的HPLC 检测方法的标样拟合方程为：y=218.74x，R2=0.999 7，平均加标回收率为98.88%，能较好满足研究的需求。

有研究表明，由于引种地与原产地环境差异和栽培技术的不同，引种后植物体内黄酮等活性成分可能低于原产地[22]。采用上述研究方法对种源地野生资源与引种5 年后栽培资源叶片中二氢杨梅素含量进行分析，发现湖北种源引种普通显齿蛇葡萄样品中二氢杨梅素含量最高，达（291.87±13.10）mg·g-1，湖北野生大叶显齿蛇葡萄样品中二氢杨梅素含量最低，为（61.43±11.17）mg·g-1。4 个种源引种的样品中二氢杨梅素含量与野生样品并无显著性差异，说明浙江杭州是显齿蛇葡萄的适生地，环境的细微变化并未对二氢杨梅素这一次生代谢产物的积累造成不利影响。

植物体内活性成分的产生、积累与生长季节密切相关，有研究表明，随着生长时间的增加，茶Camellia sinensis中茶多酚含量会随之增加[23-24]，秋季含量最高，而北京地区铁皮石斛Dendrobium officinale中多糖含量在8—9 月最高，生物碱含量在4—5 月最高[25]。植物体内二氢杨梅素的含量与季节应该也存在类似相关性，本研究针对茶叶加工的春秋两季，对显齿蛇葡萄老叶（10 月）与嫩叶（3 月）中的二氢杨梅素含量进行了分析对比，结果表明，嫩叶中的二氢杨梅素含量远高于老叶，差异最大的是贵州引种显齿蛇葡萄，嫩叶中二氢杨梅素含量是老叶中的2.07 倍，说明在实际生产中，应该尽量在春季进行采摘加工。