五种青皮核桃酒的抗氧化活性分析研究

安 睿，Davide Fornacca，李政强，佘 容，3，4，杨晓燕，3，4

（1.大理大学天然抗氧剂与抗氧化炎症研究院，云南大理 671003；2.大理大学东喜玛拉雅研究院，云南大理 671003；3.大理大学三江并流区域生物多样性保护与利用云南省创新团队，云南大理 671003；4.中国三江并流区域生物多样性协同创新中心，云南大理 671003）

氧化应激（Oxidative Stress，OS）指机体在发生各种生化反应过程中，细胞自发产生氧自由基，以及随后由氧自由基（ROS）引发一系列从细胞到全身的生理学和病理学反应过程[1]。ROS 的产生无法避免且会引起机体早期动脉粥样硬化、糖尿病、高血压、病理性肥胖与相关并发症[2-4]。抗氧化剂是可清除活性氧（ROS）及其前体，参与修复细胞损伤的化合物[5-6]，对预防某些慢性疾病如心血管疾病、神经系统疾病或炎症具有潜在的作用[7-8]。因此，人们对富含抗氧化剂的食物产生了浓厚的兴趣。

核桃（Juglans regiaL）是世界上最古老的人类种植的树生干果之一[9]，深受消费者喜爱。云南不仅核桃种植面积位居全国之首[10]，所产核桃也因高海拔种植的特点而具有极高的营养成分[11]，被誉为世界核桃家族中的上品[12]。云南核桃产业更是成为云南省推进发展高原特色现代农业和打造世界一流“绿色食品牌”的重点项目之一[13]。目前云南核桃的经济价值体现形式相对单一，主要以直接售卖核桃坚果为主，在深加工方面也仅局限于核桃饮料和核桃油[14]，鲜见其他深加工的报道。近年来，随着种植面积的扩大，产量的提高，核桃的经济价值急剧下滑，严重影响种植户的经济收入，甚至已有种植户计划移除核桃植株，改种其他作物。在此背景下，积极开发核桃的其他经济价值迫在眉睫。研究表明，核桃较其他坚果具有更强的抗氧化能力[15-16]，核桃青皮最近也被证明具有较强的抗氧化活性[17]。但是核桃青皮不能直接食用[18]，其有效成分的利用需借助一定的加工手段转化。泡酒是中国酒类传统加工工艺，能有效提取浸泡材料中的养生、保健成分，很多中医药方均采用以酒治病，历史已不下百年[19]。核桃的抗氧化能力主要源于酚类化合物[20]，酒中所含的乙醇是一种良好的酚类物质萃取剂，能使核桃青皮里的抗氧化物质被充分溶解[21]，因此，泡酒可以作为核桃的开发途径。

本研究以云南省的硬核期青皮核桃为主要原材料，参照欧洲核桃酒的制作工艺[22]酿造核桃酒，并对所得核桃酒进行ABTS 自由基清除能力、FRAP 总氧化还原能力和羟自由基清除能力的测定，评估核桃泡酒的抗氧化能力，为核桃产业经济转化探索更多有价值的可行途径，为核桃产业的可持续发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 核桃酒的制备

参照欧洲核桃酒酿造配方，并进行适当调整，具体如表1所示。

表1 核桃酒的配料表

按照配比，将取自云南的青皮核桃对半切，与其他配料一起放至提前备好的大麦酒中，密封，标记，置阳光下保存4 周，4 周后，用无菌纱布将配料从酒中过滤出来，核桃酒放置黑暗处储存，备用。未添加配料的纯大麦酒为对照。

1.1.2 试剂及耗材

ABTS 试剂：以ABTS(7 mmol/L)+K2S2O8（4.9 mmol/L，过硫酸钾）按1∶1 的体积比混合，避光储存12～16 h 后，用无水乙醇稀释，摇匀，静置5 min，734 nm 处测吸光度为0.7（±0.02），即得ABTS工作液。

FRAP 试剂：0.3 mol/L 醋酸缓冲液（pH3.6），称取0.364 g 无水醋酸钠，加入3.2 mL 冰乙酸，用RO水定容至200 mL，1 mol/L HCL调节pH3.6。

10 mmol/L TPTZ 溶液：称取0.078 g TPTZ，用40 mm 盐酸溶液稀释定容至25 mL。将上述3 种溶液依次以10∶1∶1的比例混合即得（现配现用）。

1.1.3 仪器设备

艾柯实验室超纯水机（AKDL-II-24），成都艾柯水处理设备有限公司；超声波清洗机（SB25-12DTD），宁波新芝生物科技股份有限公司；电热恒温水浴锅（HWS-26），上海-恒科学仪器有限公司；可见光分光光度计（722N），上海菁华科技仪器有限公司；比色皿（751/722 型），天锡新竹光学仪器有限公司；电子天平（PX224ZH），奥豪斯仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 ABTS自由基清除能力测定

ABTS 自由基清除率的测定参照文献[23]进行，用无水乙醇（水提取物用水）将样品提取物配置成不同浓度，备用。

量取Vit C 母液，用无水乙醇梯度稀释成与样品相同的浓度备用。将不同浓度的样品和Vit C 分别与ABTS 工作液各2 mL 混匀，每组六个平行，一个对照。避光反应6 min，立刻吸取混匀的液体至比色皿中，用溶剂调零，于734 nm 处测定各管吸光度值并记录。计算ABTS自由基清除率：

ABTS自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：Ai为样品溶液反应吸光度；Aj为样品溶液加入无水乙醇（水提取物用水）的吸光度；A0为甲醇代替样品反应吸光度。

1.2.2 FRAP总还原能力测定

FRAP 总还原能力的测定参照文献[24]进行，用无水乙醇（水提取物用水）将样品提取物配制成不同浓度，备用。取不同浓度的样品与FRAP 工作液各2 mL，混匀，37 ℃水浴10 min，于593 nm 处测定吸光度值。每组设六个平行，一个空白对照。

标准曲线绘制：用去离子水配制FeSO4溶液（浓度梯度为0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.6 mmol/L），按照上述方法测定系列标准溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，FeSO4浓度为横坐标绘制标准曲线。

样本总氧化还原能力计算：以1.0 mmol/L Fe-SO4为标准，样品氧化还原能力以达到同样吸光度所需的FeSO4的毫摩尔数表示，计算公式如下：

式中：A1为样品管的吸光度；A2为空白对照管的吸光度；A0为1 mmol/L FeSO4标准溶液吸光度。

1.2.3 羟自由基清除能力测定

样品管：取2 mL 不同浓度的样品，分别加入6 mmol/L FeSO4与6 mmol/L H2O2工作液各2 mL，混匀，静置10 min，再加入2 mL 的6 mmol/L 水杨酸，混匀放置30 min，并于510 nm 处测定吸光度值。每组设六个平行。

对照管：取2 mL 不同浓度的样品，分别加入6 mmol/L FeSO4与6 mmol/L H2O2工作液各2 mL，混匀，静置10 min，再加入2 mL 的去离子水（RO水），混匀放置30 min，并于510 nm 处测定吸光度值并记录。

计算羟自由基清除率：

式中：Ai为样品溶液反应吸光度；Aj为样品对照溶液的吸光度；A0为去离子水代替样品反应吸光度。

1.2.4 数据处理

半抑制量（IC50）：根据提取物羟自由基/ABTS自由基清除率与浓度曲线所得回归方程，计算得到5 种核桃酒将自由基原始质量浓度减少至50 %时的使用浓度（IC50）。

比活性：即提取物与Vit C IC50的比值。比活性越大，代表其自由基清除能力越强。

同时，采用Origin pro 2021 软件绘制提取物浓度与抗氧化活性关系图；SPSS 20.0 软件计算不同提取物的IC50值；使用Omic Share 云分析工具（https://www.omicshare.com）对不同种类核桃酒的IC50值进行多组检验分析。

2 结果与分析

2.1 ABTS自由基清除能力

2.1.1 样品ABTS自由基清除能力

大麦酒对ABTS 自由基的清除能力最高仅为15.27%。

5 种核桃酒对ABTS 自由基清除率除核桃酒2、核桃酒4 外，其余均随着样品稀释倍数的升高而降低，且形成较良好的线性关系。因曲线拟合较为复杂，难以判断5 种核桃酒对ABTS 自由基清除能力的强弱（图1）。

图1 核桃酒对ABTS自由基的清除活性

2.1.2 核桃酒ABTS 自由基清除率IC50多组检验分析

根据不同样本IC50值可发现，5 种核桃酒的总氧化还原能力的强弱依次为：核桃酒2＞核桃酒4＞核桃酒1＞核桃酒5＞核桃酒3。统计分析结果显示，核桃酒1、核桃酒2、核桃酒4、核桃酒5 的ABTS 自由基清除能力无显著差异，但核桃酒2 与核桃酒3具有显著差异（P＜0.01）（图2）。

图2 ABTS自由基清除率IC50多组检验分析

2.2 总氧化还原能力

2.2.1 FRAP标准曲线

标准曲线显示，FeSO4的浓度范围在0.1～1.6 mmol/L 时，吸光度随着FeSO4浓度的增加而增加，呈现较好的线性关系(y=0.6012x+0.0429，R2=0.9937)，见图3。

图3 FRAP实验的标准曲线

2.2.2 样品总氧化还原能力

大麦酒的总氧化还原能力最高为11.76，仅为核桃酒总氧化还原能力的一半。

5 种核桃酒在总氧化还原能力上无显著差异，且呈良好的线性关系。5 种核桃酒均在稀释150 倍后，还原能力趋于稳定。仅基于拟合曲线难以判断5种核桃酒总氧化还原能力的强弱，见图4。

图4 核桃酒FRAP总氧化还原能力

2.2.3 核桃酒总氧化还原能力的多组检验分析

根据不同样本IC50值可发现，5 种核桃酒的总氧化还原能力的强弱依次为：核桃酒1＞核桃酒4＞核桃酒5＞核桃酒2＞核桃酒3。统计分析显示，核桃酒2、核桃酒3、核桃酒4、核桃酒5 的总氧化还原能力无显著差异，但核桃酒1 显著高于核桃酒2、核桃酒3（P＜0.05），见图5。

图5 总氧化还原能力的多组检验分析

2.3 样本羟自由基清除能力

2.3.1 样品羟自由基清除能力

大麦酒对羟自由基的清除能力最高为41.13%。

5 种核桃酒因曲线拟合较为聚集，难以判断对羟自由基清除能力的强弱。但部分种类的核桃酒稀释400 倍以上时，其清除自由基的能力明显下降，见图6。

图6 核桃酒对羟自由基的清除活性

2.3.2 核桃酒羟自由基清除率测定的多组检验分析

对5 种核桃酒羟自由基清除率的IC50值进行比较可发现，5 种核桃酒对ABTS 自由基清除能力的强弱为：核桃酒1＞核桃酒4＞核桃酒2＞核桃酒5＞核桃酒3。统计分析结果显示，核桃酒1、核桃酒2、核桃酒4、核桃酒5 的总氧化还原能力无显著差异，但核桃酒3 与核桃酒1、核桃酒4 具有显著差异（P＜0.05），见图7。

图7 羟自由基清除率测定的多组检验分析

3 讨论

本实验使用3 种不同方法对5 种核桃酒的体外抗氧化活性进行了评价，实验结果显示：添加了青皮核桃等配料的核桃酒，不仅相较于原料纯大麦酒来说，具有更强的抗氧化能力，而且较核桃而言，也发挥出了更大的抗氧化活性[26]。5 种核桃酒之间存在抗氧化能力的强弱差异，其中核桃酒1 的FRAP还原能力与羟自由基清除能力最强，核桃酒2 的ABTS 自由基清除能力最强，核桃酒4 的所有指标均处第二位，核桃酒3 的所有指标整体评估较弱。核桃酒1、核桃酒2 与核桃酒3 配方相同，主要的差异是核桃酒1 和2 的青皮核桃含量比核桃酒3 高出50%，说明青皮核桃对总体抗氧化能力的评估起主要影响。

研究表明传统香料也具有抗氧化活性[27]。在本研究中，核桃酒2与核桃酒1的青皮核桃含量一致，但核桃酒2 的香草、肉豆蔻的含量是核桃酒1 的50%，肉桂含量为70%，原则上来说，核桃酒2的抗氧化活性应低于1，但2 对ABTS 的自由基清除能力高于1，说明香料添加过度也许会抑制ABTS 自由基清除能力。

在本研究中，添加的糖类存在差异，这也会影响核桃酒的抗氧化能力。核桃酒4 的三个抗氧化指标，在5 组样本中均排名第二，分析其配料发现，其青皮核桃含量低于2，辅料中，除糖类为冰糖，不同于2的白糖外，其他成分与核桃酒2接近，但是核桃酒4 的FRAP 还原能力与羟自由基清除能力高于2，这说明在提高核桃酒抗氧化活性方面，冰糖优于白糖。通过核桃酒4 与核桃酒5 的比较发现，核桃酒4 中青皮核桃的含量显著低于核桃酒5，但核桃酒4 在各项指标评定中均优于核桃酒5，说明添加冰糖更有利于提升核桃泡酒的抗氧化能力，具体原因有待分析。

综上所述，以青皮核桃为主料制作的核桃酒具有抗氧化能力，可以作为核桃产业的附加产品进一步开发利用。但是因添加青皮核桃的量以及辅料种类与含量的不同，其抗氧化活性存在显著差异，未来应进一步在保证核桃酒风味的前提下，调整优化主辅料配方，发挥出核桃最大的利用价值。