马铃薯吉科6号茎尖脱毒及组织快繁研究

韩艳曹丽李闯姚琪谭化王洋王娜于娅王忠伟

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133002； 2.吉林省农业科学院，吉林 长春 130033)

马铃薯作为全球第4种主要作物，产量高、营养丰富、适应性强，是生活中不可缺少的蔬菜、粮食作物，同时也是能为农民增加收入的经济作物，在吉林省地区广泛种植。在连年的种植中，由于病毒的侵染和积累，导致马铃薯植株叶片卷曲坏死、茎秆矮小细弱，块茎畸形龟裂，产量逐年降低[1]。目前，马铃薯茎尖脱毒技术已经被广泛应用，其利用马铃薯细胞的全能性及病毒在根尖和茎尖的分生组织中含量少或不含的特性[2]。在实际操作中，不同马铃薯品种的脱毒方式、茎尖大小、培养基中生长调节剂的成分、培养条件及快繁培养基成分、试管薯诱导环境存在显著差异。“吉科6号”马铃薯是吉林吉科生物高技术公司选育的新品种，具有薯块大而整齐、大薯率高、营养丰富等特点，但该品种茎尖培养成苗困难，成活率不高，生长缓慢，出现黄化死亡的现象。在进行异地快繁时，由于试管苗不易储存，运输中损耗较大，将试管苗诱导出试管薯可以有效改变这种现状，显著降低长途运输中的损耗，本研究对“吉科6号”马铃薯脱毒方式和组织快繁培养基组分进行了优化，筛选出适宜的试管薯诱导条件，建立了“吉科6号”脱毒快繁技术体系，为实现“吉科6号”马铃薯的工厂化育苗及种薯快繁提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

“吉科6号”，块茎椭圆形，薯皮光滑、黄色，薯肉黄色，芽眼浅。由吉林省农业科学院经济植物研究所马铃薯课题组提供。

1.2 试验方法

1.2.1 不同消毒方法比较

选择健康的马铃薯块茎在室温下进行催芽，待芽长3cm时，切取1cm长的茎芽作为试验材料，对茎芽进行消毒处理。试验设计6个处理，设置3次重复。每个处理30个芽，调查并记录相应的数据。具体试验设置见表1。

1.2.2 不同茎尖大小比较

在无菌条件下，将接种材料消毒后，剥离不同大小的茎尖并分析茎尖的分化生长情况。茎尖大小分别为0.1～0.2mm、0.2～0.3mm、0.3～0.4mm、0.4～0.5mm、0.5～0.6mm，每个处理30个芽，重复3次。接种到相同的诱导培养基，调查并记录相应的数据。

1.2.3 不同激素浓度配比对马铃薯茎尖成苗率的影响

将MS培养基作为基础，因为生长调节剂6-BA对芽的诱导能力强于GA3和NAA[3]，因此采用张媛媛[4]的方法，将NAA、GA3浓度固定为0.1mg·L-1同时调节6-BA的使用浓度。试验设计6个处理，每个处理30个芽，设置3次重复。调查并记录相应的数据。具体试验方案见表2。

表1 不同消毒方式

表2 不同培养基成分

1.2.4 茎段快繁

将诱导获得的脱毒小苗切去茎尖后，切成带单个腋芽的茎段，将其插入含有不同成分不同浓度多效唑PP333、矮壮素CCC、丁酰肼B9、助壮素PIX的培养基中进行扩繁，以MS培养基作为对照组，试验设置3个处理，每个处理30瓶，每瓶10个茎段。3次重复。25d后观察分析茎段的生长状况并记录相应的数据。具体试验方案见表3。

1.2.5 诱导形成试管薯

当脱毒试管苗长有6～7片叶时，去掉顶芽，取中部4～5个茎段进行马铃薯试管薯诱导培养。培养基采用MS培养基，不添加任何生长调节剂，诱导期间不更换培养基。试验设置9个处理，每个处理30瓶，每瓶10个茎段，3次重复。光照时间为8h·d-1，诱导4周，再进行4周全黑暗诱导。全黑暗诱导4周后进行收获，统计每个处理试管秒诱导生产试管薯的大薯数(≥0.05g)、大薯重、小薯数(<0.05g)、小薯重、结薯数和结薯重，并进行数据分析。具体试验方案见表4。

表3 不同培养基成分

表4 诱导环境

1.2.6 数据分析

数据采用WPS进行处理，DPS 7.05软件进行统计分析。

茎尖成活率=成活茎尖个数/接种茎尖个数

接种3个月后统计。

茎尖成苗率=成苗茎尖个数/成活茎尖个数

接种6个月后统计。

脱毒率=无病毒株数/检测株数

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法比较

试验选择0.1%升汞和0.1%NaClO作为主要灭菌剂，研究不同浸泡时间对消毒效果的影响，结果如表5所示，随着灭菌时间的增加，染菌率和成活率均呈现下降的趋势，根据各处理结果对染菌率及成活率的影响，推荐采用自来水冲洗20min加0.1%升汞浸泡7min加75%乙醇浸泡1min加无菌水冲洗2次的消毒方法用于马铃薯“吉科6号”茎芽消毒处理，染菌率降至17%的同时可以保障成活率达到92.22%。

表5 不同消毒方法对茎尖染菌率及成活率的影响

2.2 不同茎尖大小比较

由表6可以看出，马铃薯“吉科6号”成活率与茎尖剥离的大小呈正相关，成活率随着茎尖剥离长度的增加而逐渐升高：与脱毒率呈负相关，脱毒率随着茎尖剥离长度的增加而逐渐降低。在本试验条件下，适宜马铃薯“吉科6号”剥离茎尖最佳大小为0.3～0.4mm，脱毒率达到48.89%，成活率达到49.6%。

表6 不同茎尖大小对脱毒率及成苗率的影响

2.3 不同激素浓度配比对马铃薯茎尖成苗率的影响

生长调节激素赤霉素GA3能抑制愈伤组织的形成，且有助于马铃薯茎尖生长和分化；细胞分裂素6-BA可诱导芽的分化，但不利于茎的伸长；生长素NAA可促进茎的伸长，但不利于芽的分化增殖，将上述3种激素混合使用，可以有效调节马铃薯试管苗的生长。由表7可以看出，生长调节激素6-BA、NAA、GA3对马铃薯茎尖的诱导分化影响显著，在本研究中，处理2的成活率最高为93.33%，与处理3之间不存在显著性差异，与其他处理均存在显著性差异；处理3的成苗率最高为74.07%，与其他处理存在显著性差异，因此，综合分析得出，在本试验中最适宜马铃薯“吉科6号”的生长调节剂组合是MS加0.1mg·L-1NAA加0.1mg·L-1GA3加0.15mg·L-16-BA。

表7 不同生长调节激素组合调节下马铃薯茎尖成苗情况

2.4 不同成分培养基对茎段生长的影响

表8 不同培养基中茎段生长情况

由表8可以看出，在添加各种生长延缓剂的培养中，虽然马铃薯“吉科6号”试管苗在对照培养基中根长、株高显著大于其他处理，但是在生根率、茎粗、新增单芽节数方面明显低于其他处理。使用过生长抑制剂的处理植株变得矮而粗壮，更有利于移栽及试管薯的诱导。在本试验中，MS加PIX 0.5mg·L-1的培养基组合，对促进马铃薯“吉科6号”脱毒苗生根，增加茎粗，抑制徒长，促进壮苗等综合效果最佳。

2.5 诱导形成试管薯

由表9可以看出，当温度在20℃，光照强度为80μmol·m-2·s-1，光照8h·d-1，诱导4周，黑暗诱导4周，结薯数2218.96个和结薯重14.84g显著高于其他处理，是最适宜马铃薯“吉科6号”的试管薯诱导方法。

表9 温度和光照强度对试管薯形成的影响

3 讨论与结论

影响马铃薯茎尖脱毒效果及脱毒苗快繁、试管薯诱导的因素有很多。外植体的消毒是马铃薯茎尖脱毒技术取得成功的基础，对于茎尖的处理既要使其不受污染，又要确保其成活状态，现有的研究报道表明[5]，氯化汞或次氯酸钠与75%乙醇组合使用对马铃薯茎尖的消毒效果较好；茎尖剥离的大小是影响马铃薯茎尖脱毒的关键因素，现有的研究表明[6]，茎尖剥离保留1～2个叶原基，可以保证茎尖的脱毒率及成活率；在MS培养基中加入生长调节剂GA3、6-BA、NAA制成分化培养基，分化培养基的成分及浓度是影响成苗的关键，浓度过低会出现大量愈伤组织无法分化成苗，浓度过高，会出现黄化现象，导致成活率降低，现有研究表明[7]，上述常用的3种生长调节剂对马铃薯的作用存在差异。多效唑(PP333)、矮壮素(CCC)、丁酰肼(B9)和助壮素(PIX)等生长延缓剂，可增强试管苗的适应性和抗性，能显著提高移栽成活率。研究表明[8]，影响马铃薯试管薯形成的因素很多，温度、光照、黑暗诱导时间、马铃薯品种等。

鉴于已有的研究报道结果，本研究以马铃薯新品种“吉科6号”茎尖为外植体，对其消毒方式、剥离茎尖大小、生长调节剂成分、快繁培养基组分、试管薯诱导环境进行了优化。在本试验中，确定了用自来水冲洗20min加0.1%升汞浸泡7min加75%乙醇浸泡1min加无菌水冲洗2次对马铃薯“吉科6号”茎芽消毒处理后，污染率降至17%；确定茎尖剥离长度为0.3～0.5mm，脱毒率48.89%，成活率49.6%；用MS加0.1mg·L-1NAA加0.1mg·L-1GA3加0.15mg·L-16-BA培养基诱导茎尖分化成苗，成活率90%，成苗率74.07%。再经MS加PIX 1.0mg·L-1培养基继代，可获得大量健壮的马铃薯无菌种苗，之后在培养室内温度调至20℃，光照强度调至80μmol·m-2·s-1，光照时间调至8h·d-1，诱导4周，之后全黑暗诱导4周，可以获得大量试管薯，满足长途运输及工厂化生产的目标。