滇重楼组织培养初代培养体系初探

李金月 陈志怡

(毕节职业技术学院，贵州 毕节 551700)

滇重楼(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)即云南重楼，是我国重要的药用植物，收录于历版《中国药典》[1]。重楼属植物我国种类最多，为该属植物的分布中心之一，约有20种，变种10种，全国大部分地区有分布，主产于云南、四川、贵州、广西等地[2]。贵州重楼属药用植物资源共有9变种1变型，其中有2个变种为贵州特有[3]。重楼具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效，用于治疗臃肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、凉风抽搐等症[4]。重楼是云南白药、四川白药、宫血宁、夺命丹等一些重要中成药和新药的主要原料之一[2,5]。

植物组织培养技术是目前人们最为关注的解决重楼无性快速繁育瓶颈的途径之一。侯玉平[6]等对滇重楼切块繁殖不定芽发生的组织学研究认为，滇重楼切块繁殖时不定芽起源于薄壁组织细胞脱分化，为多细胞起源，不经过愈伤组织阶段，为直接发生。鉴于此，本文以滇重楼根状茎为试材，进行滇重楼组织培养初代培养体系研究，以期为重楼属植物组织培养快速繁殖技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验选取生长健康、无病虫害的二年生滇重楼根状茎的第1节间为外植体。

1.2 方法

1.2.1 外植体处理方式

选取生长状况良好、无病虫害的滇重楼二年生根状茎，用自来水和洗衣粉将其表面泥土洗净，流水冲洗1.5h，然后放入浓度为0.5%的消清灵溶液中浸泡30min，取出洗净后的外植体在阴凉处晾干备用。

经过处理的外植体，在超净台上先用75%的酒精溶液消毒1min，无菌水冲洗3次，然后用0.1%升汞消毒处理8min，再用无菌水冲洗4次，用无菌滤纸吸干材料表面的水分备用。

消毒处理后的根状茎，切取根状茎上第1个节间作为外植体。

1.2.2 初代培养诱导培养基成分的筛选

以MS加6g·L-1琼脂加30g·L-1蔗糖，pH5.8为基本培养基，试验设计参照表1所示L16(43)正交设计表进行，具体植物生长调节剂与抗生素浓度配比见表2。

将1.2.1中消毒处理并切好的外植体，按照每处理3个重复，每重复10瓶，每瓶2～3个外植体，接种于表2所示植物生长调节剂与抗生素配比的培养基上。在光照时间10h·d-1、光照强度2500lx，培养温度(25±2)℃条件下培养80d，记录培养材料综合生长情况，计算各处理的启动率、褐化率、污染率等。通过数据处理确定滇重楼初代培养诱导培养基的最佳成分。

表1 L16(43)正交试验设计

表2 植物生长调节剂与抗生素配比表

2 结果与分析

2.1 不同浓度6-BA处理对滇重楼组培的影响

从表3可以看出，MS加2,4-D 1.0mg·L-1培养基添加不同浓度6-BA对外植体启动率、褐化率、启动培养时间、丛生芽形成时间等都有影响。

外植体启动率随着6-BA浓度的升高呈现先上升后下降的趋势，以6-BA浓度为2.5mg·L-1时启动率最高，为63.66%。

外植体褐化率随着6-BA浓度的升高呈现上升的趋势，以6-BA浓度为3.5mg·L-1时褐化率最高，为56.08%。

外植体接种以后都有不同程度的污染，5d以后基本稳定，没有出现新的污染。接种后20d开始，在切口处陆续有瘤状物出现，瘤状物出现早晚随着6-BA的升高呈现先晚后早又晚的现象。以6-BA浓度为2.5mg·L-1时瘤状物出现最早，为接种后21d左右开始出现。以6-BA浓度为0.5mg·L-1时瘤状物出现最晚，为接种后41d左右开始出现。

外植体诱导形成丛生芽的时间，以6-BA浓度为2.5mg·L-1时最早，为接种后53d左右；以6-BA浓度为0.5mg·L-1时最晚，为接种后76d左右。

苗的质量以6-BA浓度为2.5mg·L-1时最高，不仅苗量多，而且颜色深绿、生长健壮。

因此，在以二年生滇重楼根状茎的第1节间为外植体，以MS加2,4-D 1.0mg·L-1为培养基时，建议添加2.5mg·L-1的6-BA。

2.2 不同浓度2,4-D处理对滇重楼组培的影响

在植物组织培养培养中，2,4-D对愈伤组织的诱导和生长非常有效，但往往抑制芽的形成，影响器官发育[7]。

表3 不同浓度6-BA处理对滇重楼外植体诱导的影响

如表4所示，MS加6-BA 2.5m·L-1培养基添加不同浓度2,4-D，对外植体启动率、褐化率、启动培养时间等影响不太明显，但是对外植体再生途径有影响。随着2,4-D浓度的升高，外植体趋向诱导形成愈伤组织，丛生芽生长受到抑制。随着6-BA与2,4-D浓度比值的下降，外植体形成的愈伤组织增加，而丛生芽减少。

由于植物组织培养中丛生芽途径具有遗传性状稳定，繁殖速度快的特点[7]，在滇重楼快速繁殖中应该优先考虑此途径。因此，建议在以二年生滇重楼根状茎的第1节间为外植体进行快速繁殖时，培养基中尽量少添加2,4-D，控制6-BA与2,4-D的浓度比大于1，或者不添加2,4-D。

2.3 不同浓度盐酸特比萘芬处理对滇重楼组培的影响

在MS加6-BA 2.5mg·L-1加MS加2,4-D 1.0mg·L-1培养基中添加不同浓度的盐酸特比萘芬，对外植体的诱导率、污染率、启动时间等都有影响。

外植体的启动随着盐酸特比萘芬浓度的升高呈先上升后下降的趋势，以盐酸特比萘芬浓度为150mg·L-1时最高，为68.34%；外植体的污染率随着盐酸特比萘芬浓度的升高呈先上升后下降的趋势,以盐酸特比萘芬浓度为150mg·L-1时最低，为26.73%。

外植体的启动时间在盐酸特比萘芬浓度低时变化不大，当其浓度达到250mg·L-1时，启动时间推后；随着盐酸特比萘芬浓度的升高，丛生芽形成时间与外植体的启动时间呈相同的趋势。

因此，建议在滇重楼的初代培养中添加低浓度的盐酸特比萘芬，可以减少外植体的真菌污染。

表4 不同浓度2,4-D处理对滇重楼外植体诱导的影响

表5 不同浓度盐酸特比萘芬处理对滇重楼外植体诱导的影响

3 结论

本文以二年生滇重楼根状茎的第1节间为外植体，研究了在初代诱导培养基中添加不同浓度6-BA、2,4-D和盐酸特比萘芬对外植体启动率、褐化率、启动培养时间、形成丛生芽时间、外植体再生途径等方面的影响。

侯玉平[6]等研究认为，滇重楼切块繁殖时可以不经过愈伤组织阶段，直接形成苗。在植物组织培养中，植物生长调剂的添加至关重要，决定了外植体的再生途径。细胞分裂素类有利于芽的形成，生长素类有利于根的形成和诱导形成愈伤组织。而植物组织培养中丛生芽途径具有遗传性状稳定、繁殖速度快的特点[7]。细胞分裂素类与生长素类配比浓度比值高时有利于芽的形成。

因此，为了加快滇重楼快速繁殖体系的建立，建议选择二年生滇重楼根状茎的第一节间为外植体，通过调节细胞分裂素类与生长素类配比浓度，使其经过丛生芽途径快速成苗。