液相色谱法对动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定

招钰娟 何国成 林庆昶 周秀莹 贾晓菲 林小贞 黎小鹏

(中山市农产品质量安全检验所，广东 中山 528437)

磺胺类药物(sulphonamides,SAs)是人工合成的抗菌药，早在1935年开始用于临床，与其他抗菌药相比其应用的时间较长，具有性质稳定、使用简便、抗菌谱广等特点，至今在养殖生产和临床中仍广泛使用，是重要的化学治疗药物。我国的养殖生产还处于散户养殖较多的阶段，部分养殖户由于对抗菌药缺乏了解而未合理使用或过度使用，引起细菌对于磺胺类药物的耐药性，药物残留从而污染下游产品，进而危害人体健康。近年的研究表明，长期对动物使用SAs，特别是磺胺甲噁唑、磺胺喹噁啉等，残留物有可能引起人体过敏、中毒、造血功能障碍、急性溶血性贫血、粒细胞缺乏症等，也有致畸、致癌、致突变的“三致”作用，并可能导致耐药性菌株产生，造成生态环境污染[1]。因此，为了保障动物用药的安全性和有效性，国际食品法典委员会(CAC)以及许多的国家都对动物源性食品中的SAs含量都作了非常严格的规定[2]，我国在《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》GB 31650-2019中明确要求，所有动物产品中SAs的最高残留限量为0.1mg·kg-1，同时磺胺二甲基嘧啶在牛奶中的残留限量为0.025mg·kg-1。

SAs是以对氨基苯磺酰胺结构为主体的药物总称，一般为白色或微黄色结晶性粉末，遇光易变质，颜色逐渐变深，有共同的对-氨基苯磺酰胺母核结构，大多数SAs具有酸碱两性，可溶于酸或碱溶液中，也较易溶于乙醇、乙腈或丙酮中；大多数SAs在水中溶解度极低[3]。根据SAs的理化特点，研究人员开发了多种检测方法，主要有荧光光谱法[4]、化学发光法[5]、表面增强拉曼光谱法[6]、电化学法[7]、免疫分析法[8]、微生物抑制法[9]、毛细管电泳法[10]、高效液相色谱法[11]、液相色谱-串联质谱法[12,13]。我国有关部门已发布多个磺胺类药物残留量的检测标准，主要使用液相色谱法和液质联用技术。液质联用是目前SAs定性定量检测灵敏度高、准确性好的方法，但由于仪器昂贵，对使用人员要求高，在基层实验室尚未普及。而液相色谱-紫外检测器，是多数实验室配置的仪器，绝大部分基层实验室已配置，具有选择性高，定量准确、稳定，灵敏度适用等优点。针对我国畜禽养殖目前还处于散户养殖阶段的特点，基层实验室使用液相色谱法开展SAs残留量检测，及时发现养殖生产中滥用抗菌素的问题，可预防超标产品进入市场危害人们健康。目前现行有效的SAs液相色谱检测标准，多发布于十多年前，前处理操作比较复杂，随着检测技术理论的发展，并针对各自实验室的仪器、人员配置等实际情况开展研究，选择出结果稳定、操作简易的前处理和仪器方法，具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-紫外检测器HPLC1260-VWD(安捷伦科技有限公司)；振荡摇床KS-501(德国IKA集团)；涡漩振荡器(德国IKA公司)；离心机Sigma 3-30KS(德国Sigma离心机有限公司)。

5种磺胺标准品，磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉，购自德国DrEhrenstorferGmbH公司。

乙腈、甲酸(色谱纯,Fisher公司)；无水硫酸钠(分析纯，广州化学试剂厂)；碱性氧化铝固相萃取柱(6mL，2g SUPELCO)、0.2μm PTFE针式过滤器(安捷伦科技有限公司)；实验室用水为Milli-Q超纯水。

洗脱液：25mL乙腈加0.3mL甲酸加75mL水混合，摇匀。

1.2 提取

取畜禽肌肉、肝脏样品，搅拌成匀浆状。称取5.00g(±0.05g)试样于50mL离心管中，加入约5mL水、2颗陶瓷均质子、20.00mL甲酸乙腈(甲酸0.3%)，摇床震荡30min，300rpm。加入8～10g无水硫酸钠，涡旋震荡1min，8000rpm离心5min，全部上清液转至另一50mL离心管，加入约15mL正己烷，涡旋震荡1min，弃去上层，再加入约15mL正己烷，涡旋震荡1min，8000rpm离心5min，下层(乙腈层)备用。

1.3 净化

准确吸取上述备用液(下层)16.00mL注入已活化的碱性氧化铝固相萃取柱，上样前用10mL乙腈活化，在自然重力下流出，弃去滤液，挤干，2mL洗脱液洗脱，重复1次，收集全部洗脱液，定容至总体积4mL，过0.2μm PTFE针式过滤器后上机检测。

1.4 标准溶液配制

分别准确称取5种磺胺类药物10mg (精确至0.01 mg)，用甲醇溶解并定容至10mL,配制成1mg·mL-1的标准储备液。

分别准确移取上述单一标准溶液0.10mL于同一10mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，得到10μg·mL-1的混合标准储备液，于-18℃以下保存。

准确吸取混合标准储备液0.10mL于样品瓶中，加入0.90mL洗脱液，得到1000μg·L-1的混合标准溶液；精确吸取一定量的混合标准溶液，用洗脱液稀释成质量浓度为20μg·L-1、50μg·L-1、100μg·L-1、200μg·L-1、500μg·L-1、1000μg·L-1的标准工作溶液。

1.5 色谱条件

色谱柱，Agilent Pursuit 5 C18(150mm×4.6mm，5.0μm)，柱温为35℃；检测波长270nm；进样量20.0μL，流量1.000mL·min-1，流动相洗脱程序如表1所示，后运行时间1min。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择

乙腈[14]和乙酸乙酯[15]是SAs常用的提取溶剂，而SAs容易在酸性溶液中离子化[16]，提高提取效率。同时考虑到畜禽产品含有较高的蛋白质，容易对检测造成干扰，含有乙腈的提取溶剂具有沉淀蛋白、减少共提物的作用[17]，结果则为色谱图的杂峰较少。本研究比较了乙腈、甲酸乙腈和乙酸乙酯3种提取溶剂，考察添加浓度0.040mg·kg-1的回收率和相对标准偏差值，观察加标样品的色谱图，比较不同提取溶剂对后续净化步骤操作便利性的影响等多种因素，优选出甲酸乙腈作为本试验的提取溶剂。

2.2 净化方法的选择

本试验使用液相色谱-紫外检测器，检测波长270nm，与液质联用法相比选择性较弱，只是以保留时间作为定性条件，净化效果低的方法容易产生干扰。比较QuEChERS[18]净化管(内含50mg PSA、150mg C18EC 和900mg Na2SO4，15mL)、阳离子交换(MCX)固相萃取柱[19]、碱性氧化铝固相萃取柱[14,20]3种净化方法，3种方法的加标回收率均在70%～110%，但QuEChERS净化管的色谱图有比较多杂峰，容易产生干扰；MCX柱容易发生堵塞现象[21]，选择碱性氧化铝SPE柱作为本研究的净化方法。使用甲酸乙腈作提取溶剂，结合碱性氧化铝柱净化，经优化后整个前处理不需要使用旋转蒸发仪、氮吹仪浓缩或置换有机溶剂，大大减少前处理时间，简化操作，也能减少SAs的挥发，提高提取净化效率，提高结果的准确性。与赵敏儿[22]的实验结论一致。

2.3 方法学考察

2.3.1 定量方法的线性检测范围

以混合标准溶液的浓度为横坐标，各目标化合物色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其线性关系相关系数、回归方程见表2。5种磺胺在0.02～1000mg·L-1范围内线性关系良好，r2值均大于0.9999。

2.3.2 方法检出限

方法检出限按低浓度点0.05mg·kg-1的响应值与基线噪声响应的3倍计算，检出限结果见表2。5种磺胺的方法检出限为0.003～0.005mg·kg-1，能满足动物源性食物中磺胺类抗生素的检测。5种磺胺类药物标准溶液色谱图见图1。

表2 动物源性食物中5种磺胺的回归方程、相关系数、检出限

2.3.3 方法回收率和精密度

在相同的试验条件下，分别对6个空白鸡肉、猪肝、脂肪样品添加浓度为0.020mg·kg-1、0.040mg·kg-1、0.200mg·kg-1的5种磺胺混合标样，进行加标回收和精密度测试，同时进行空白试验，测试结果见表3。5种磺胺的加标回收率为80.1%～108%，相对标准偏差2.48%～10.0%。方法具有很好的回收率和精密度。

图1 5种磺胺类药物标准溶液色谱图(0.05μg·mL-1)

表3 动物源性食物中5种磺胺的加标浓度、加标回收率和相对标准偏差

3 结论

本研究通过优化提取溶剂，有效提高提取效率，简化提取步骤；使用正己烷前处理，并优选出固相萃取小柱同时富集和净化，简化整个前处理的步骤，无需旋转蒸发仪浓缩、氮吹仪置换溶剂，大大提高工作效率，前处理操作比较简便。结合高效液相色谱和紫外检测器，建立了操作简便、回收率高、准确稳定的动物性食品中5种常用磺胺类药物残留的分析方法,易于在基层实验室开展测定，及时发现养殖生产中的磺胺类药物滥用情况，为农业行政主管部门制定政策和加强管理提供参考。