Garcinone C对鼻咽癌细胞衰老、迁移和侵袭功能的影响及作用机制研究

张 菡， 韦 丹， 蔡美婷， 尹富强， 刘 夏

鼻咽癌是一种源于鼻咽部的鳞状上皮细胞癌，在我国南方地区和东南亚国家的发病率较高。2018年全世界报告鼻咽癌病例约12.9万例[1]。鼻咽癌的临床治疗方法主要有放疗以及放疗联合化疗[2]，但鼻咽癌细胞发生转移极大地降低了晚期鼻咽癌患者的生存率[3]。因此，亟需寻找能够抑制癌细胞迁移与侵袭的新化疗药物。氧杂蒽酮类化合物是一类含氧杂环化合物，具有广泛的生物活性，具有抗癌[4]、抗艾滋病毒[5]、抗菌[6]等作用，在药物化学领域具有重要的意义。近年来的研究显示，氧杂蒽酮类化合物可以抑制鼻咽癌、乳腺癌、胰腺癌等癌细胞的增殖[7-8]。Garcinone C是从药用植物山竹(GarciniamangostanaL)中提取的一种氧杂蒽酮类天然化合物，有报道显示其在结肠癌[9]和鼻咽癌[7]具有抗肿瘤活性，但对鼻咽癌细胞转移的影响作用研究未见报道。鉴此，本研究从细胞层面，以鼻咽癌细胞系HK1和HONE1作为实验对象，通过体外实验检测不同浓度的Garcinone C对细胞衰老、迁移及侵袭能力，以及对铁死亡的影响，探讨Garcinone C对鼻咽癌的作用机制，为鼻咽癌治疗药物的研发提供候选先导化合物。

1 材料与方法

1.1主要实验试剂 Garcinone C(分子式为C23H26O7)，由课题组从山竹GarciniamangostanaL果皮中提取、分离并纯化[7]。DMEM高糖培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、杜氏磷酸缓冲盐溶液(Dulbecco′s phosphate buffered saline，D-PBS)均购自加拿大WISENT公司。胰蛋白酶、抗生素-青霉素链霉素均购自美国Gibco Life Technologies公司。蛋白定量BCA试剂盒、ECL化学发光液均购自美国Thermo Scientific Pierce公司。β-半乳糖苷酶衰老试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。RIPA细胞裂解液购自美国Sigma-Aldrich公司。无基质胶Transwell小室、含基质胶Transwell小室均购自美国Corning公司。0.1%结晶紫溶液购自北京索莱宝科技有限公司。30%丙烯酰胺、电泳缓冲液、印迹膜转印缓冲液、预染蛋白Marker均购自上海生工生物工程股份有限公司。PVDF膜购自美国Merck Millipore公司。一抗E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶组织抑制剂2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2,TIMP2)蛋白、铁蛋白重链1(ferritin heavy chain 1,FTH1)、胱氨酸转运体蛋白xCT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)以及HRP标记山羊抗兔IgG二抗(Anti-rabbit IgG)均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2主要仪器 倒置荧光显微镜(Olympus,BX53)，恒温细胞培养箱(Thermo Scientific,3111)，低温高速离心机(Eppendorf,5424R)，-80 ℃超低温冰箱(Haier,DW-86L628)，低速离心机(湘仪，TD5A-WS)，全波长酶标仪(Thermo Scientific,Multiskan GO)，BD电泳仪(Bio Rad,PowerPac Basic)，化学发光成像系统(中国赛智创业公司，MiniChemi 610Plus型)。

1.3细胞培养 鼻咽癌细胞株HK1和HONE1受赠于中山大学肿瘤防治中心钱朝南教授。HK1和HONE1细胞均使用含有10% FBS、1% 100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素的DMEM完全培养基，在5% CO2、37 ℃的饱和湿度恒温培养箱中进行培养，当细胞汇合度达到80%～85%时进行传代培养。

1.4HONE1细胞衰老检测 取对数生长期的HONE1细胞接种于12孔板中，每孔600个细胞，设置3个平行孔。16 h后用DMEM完全培养基稀释Garcinone C母液，并设置4个浓度梯度(0 μM、2.50 μM、3.75 μM、5.00 μM)以及一个空白对照。培养11 d后吸除孔中的旧培养液，D-PBS洗1遍后用β-半乳糖苷酶固定液室温固定15 min，每孔500 μl。吸除固定液，以D-PBS洗3遍后加入β-半乳糖苷酶染色工作液，每孔500 μl，置于37 ℃恒温箱中孵育过夜。第2天取出12孔板，在普通光学显微镜下观察计数并拍照。β-半乳糖苷酶染色液染色后的衰老阳性细胞呈蓝色，阴性细胞无着色。

1.5HK1和HONE1细胞迁移能力检测 取对数生长期的HK1和HONE1细胞，常规消化、离心，重悬细胞时使用不含FBS的DMEM基础培养基，将HK1细胞悬液稀释成5×105cells/ml，HONE1为4×105cells/ml。将细胞接种于Transwell小室的上室中，每孔500 μl，分别设3个药物浓度梯度(HK1细胞组为5.00 μmol/L、7.50 μmol/L、10.00 μmol/L；HONE1组为3.75 μmol/L、5.00 μmol/L、7.50 μmol/L)和一个空白对照。Transwell小室的下室加入含10% FBS的DMEM完全培养基，每孔750 μl。作用24 h后，取出Transwell小室，吸除小室内的培养液，用D-PBS洗2遍后加入4%多聚甲醛750 μl固定20 min，D-PBS洗2遍，0.1%结晶紫染色20 min，D-PBS洗2遍后用湿润的棉签擦去上室中未迁移的细胞，在光学显微镜下观察并拍照。使用Image J软件计数迁移细胞数，细胞迁移比例=药物处理组迁移细胞数/对照组迁移细胞数×100%。

1.6HK1和HONE1细胞侵袭能力检测 细胞侵袭能力检测实验方法与上述的细胞迁移能力检测实验方法(方法1.5)相似。不同的是，Transwell小室的基底膜上有一层Matrigel基质胶，小室在使用前要先经水化：分别向小室的上、下室加入无FBS的DMEM培养基500 μl，在37 ℃的恒温培养箱中水化2 h。细胞处理24 h后，取出小室，先用湿润的棉签将上室中未穿过基底膜的细胞擦去，再固定、染色。在光学显微镜下观察并拍照，使用Image J软件计数侵袭细胞数，细胞侵袭比例=药物处理组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数×100%。

1.7HK1和HONE1细胞转移相关蛋白及铁死亡相关蛋白检测 通过Western blot实验进行检测。取对数生长期的HK1和HONE1细胞，接种于10 cm的培养皿中，16 h后分别加入Garcinone C(5.00 μmol/L、7.50 μmol/L、10.00 μmol/L)，每组设一个空白对照。分别作用24 h、48 h后用RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白。BCA试剂盒检测蛋白浓度，将蛋白浓度调至相同后加热变性。通过10% SDS-PAGE凝胶电泳90 min分离蛋白质，恒压90 V转膜3 h，5%脱脂奶粉液封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜(N-cadherin、E-cadherin、TIMP2、FTH1、xCT均以1∶1 000稀释)，第2天孵育二抗(1∶5 000)1 h，加入ECL化学发光液，应用化学发光成像系统曝光显影，拍照记录，以GAPDH作为内参计算目标蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1Garcinone C诱导HONE1细胞衰老实验结果 β-半乳糖苷酶染色实验结果显示，梯度浓度Garcinone C(2.50 μmol/L、3.75 μmol/L、5.00 μmol/L)处理HONE1细胞11 d后，衰老细胞染色率较空白对照组(0 μmol/L Garcinone C)显著上升，且有药物浓度依赖性，四组衰老细胞染色率比较差异有统计学意义(F=1 253.695，P<0.001)。见图1。

光学显微镜下所见(β-半乳糖苷酶染色×200)及四组衰老细胞染色率比较，与空白对照组比较，aP<0.05；与2.50 μmol/L Garcinone C组比较，bP<0.05；与3.75 μmol/L Garcinone C组比较，cP<0.05

2.2Garcinone C抑制HK1和HONE1细胞的迁移能力实验结果 Transwell细胞迁移实验结果显示，不同浓度的Garcinone C分别处理HK1和HONE1细胞24 h后，与空白对照组相比，药物干预组中穿过基底膜的细胞比例显著减少，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义(HK1细胞：F=201.208，P<0.001；HONE1细胞：F=397.185，P<0.001)。见图2。

ⓐHK1细胞镜下所见(结晶紫染色，×200)及四组穿过基底膜的细胞比例比较。与0 μmol/L Garcinone C组比较，aP<0.05；与5.00 μmol/L Garcinone C组比较，bP<0.05；与7.50 μmol/L Garcinone C组比较，cP<0.05；ⓑHONE1细胞镜下所见(结晶紫染色，×200)及四组穿过基底膜的细胞比例比较。与0 μmol/L Garcinone C组比较，aP<0.05；与3.75 μmol/L Garcinone C组比较，bP<0.05；与5.00 μmol/L Garcinone C组比较，cP<0.05

2.3Garcinone C抑制HK1和HONE1细胞的侵袭能力实验结果 Transwell细胞侵袭实验结果显示，不同浓度的Garcinone C分别处理HK1和HONE1细胞24 h后，与空白对照组相比，药物干预组中侵袭的细胞比例显著减少，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义(HK1细胞：F=166.242，P<0.001；HONE1细胞：F=84.964，P<0.001)。见图3。

ⓐHK1细胞镜下所见(结晶紫染色，×200)及四组穿过含基质胶基底膜的细胞比例比较，与0 μmol/L Garcinone C组比较，aP<0.05；与5.00 μmol/L Garcinone C组比较，bP<0.05；ⓑHONE1细胞镜下所见(结晶紫染色，×200)及四组穿过含基质胶基底膜的细胞比例比较。与0 μmol/L Garcinone C组比较，aP<0.05；与3.75 μmol/L Garcinone C组比较，bP<0.05；与5.00 μmol/L Garcinone C组比较，cP<0.05

2.4不同浓度Garcinone C对HK1和HONE1细胞转移相关蛋白表达水平的影响 Western blot实验结果显示，经不同浓度的Garcinone C分别处理HK1和HONE1细胞后，E-cadherin、TIMP2表达水平上升(P<0.05)，N-cadherin表达水平下降(P<0.05)，且有剂量依赖性。见图4。

ⓐ不同浓度Garcinone C对HK1细胞转移相关蛋白表达的影响，与0 μmol/L Garcinone C组比较，aP<0.05；与5.00 μmol/L Garcinone C组比较，bP<0.05；与7.50 μmol/L Garcinone C组比较，cP<0.05；ⓑ不同浓度Garcinone C对HONE1细胞转移相关蛋白表达的影响，与0 μmol/L Garcinone C组比较，aP<0.05；与5.00 μmol/L Garcinone C组比较，bP<0.05；与7.50 μmol/L Garcinone C组比较，cP<0.05

2.5不同浓度Garcinone C对HK1和HONE1细胞铁死亡相关蛋白表达水平的影响 Western blot实验结果显示，经不同浓度的Garcinone C分别处理HK1和HONE1细胞后，FTH1和xCT蛋白表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

ⓐ不同浓度Garcinone C对HK1细胞铁死亡相关蛋白表达的影响，与0 μmol/L Garcinone C组比较，aP<0.05；与5.00 μmol/L Garcinone C组比较，bP<0.05；与7.50 μmol/L Garcinone C组比较，cP<0.05；ⓑ不同浓度Garcinone C对HONE1细胞铁死亡相关蛋白表达的影响，与0 μmol/L Garcinone C组比较，aP<0.05；与5.00 μmol/L Garcinone C组比较，bP<0.05；与7.50 μmol/L Garcinone C组比较，cP<0.05

3 讨论

3.1广西是鼻咽癌高发的地区，鼻咽癌病理类型多为非角化型鳞状细胞癌[10]。原发鼻咽癌的治疗主要以放疗或放化疗结合为主，部分患者会出现癌细胞转移到其他器官，包括骨、肺、肝和远处淋巴结等[4]。转移病例的治疗仍是以化疗为主，但耐药率较高[11]。局部复发和远处转移是鼻咽癌治疗失败的主要原因[12]，因此，亟需寻找新的化疗药物。

3.2天然产物是抗肿瘤新药研发的重要途径之一。山竹是一种藤黄属植物，含有一类特殊的化学物质——氧杂蒽酮类化合物，包括gartanin、β-mangostin、γ-mangostin、Garcinone E和Garcinone C等。有研究表明这些氧杂蒽酮类化合物具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性[12]。Chen等[9]研究发现，Garcinone C可以通过调节Hedgehog信号通路在体内外抑制结肠肿瘤的发生。Garcinone E与Garcinone C同为山竹果皮提取的蒽醌类化合物。已有研究表明，Garcinone E可以抑制卵巢癌[13]和鼻咽癌[14]的转移。本研究结果也显示，Garcinone C可显著抑制HK1和HONE1细胞迁移和侵袭，诱导HONE1细胞衰老，诱导HK1和HONE1细胞的铁死亡。

3.3天然产物诱导肿瘤细胞衰老是抑制肿瘤发展的主要途径之一，可使癌细胞永久性丧失增殖能力，达到抗肿瘤效果。癌细胞的迁移和侵袭与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)密切相关。EMT是一个发育过程，是指极化后的上皮细胞停止维持细胞间的接触，失去细胞极性，并获得间充质细胞特性，如运动性、收缩能力和侵袭性[15]。在EMT进程中，通常伴随着N-cadherin表达上调及E-cadherin表达下调。E-cadherin是介导相邻细胞间同质性黏附的主要蛋白，E-cadherin表达下调被广泛认为是EMT发生的标志[16]。因此，上调E-cadherin的表达可以逆转EMT，抑制肿瘤细胞的转移。有研究显示，上调E-cadherin可以显著抑制鼻咽癌[17]、乳腺癌[18]细胞的转移和侵袭。细胞外基质是防止肿瘤细胞侵袭的天然屏障，基质金属酶是诱导细胞外基质发生降解的重要蛋白酶，TIMP2是基质金属蛋白酶的抑制因子，在多种肿瘤细胞中低表达[19]。有研究表明，上调TIMP2表达可以抑制卵巢癌和肝癌细胞的侵袭[13，20]。

3.4铁死亡是一种调节细胞程序性死亡的机制，当铁依赖性脂质过氧化物积累到一定程度时就会触发铁死亡[21]。越来越多的证据表明，诱导肿瘤细胞铁死亡具有治疗癌症的可能，特别是对传统治疗方法产生耐药性的侵袭性恶性肿瘤[22]。在铁死亡过程中，FTH1和xCT蛋白表达下调。FTH1具有铁氧化酶活性[23]，可促进铁吸收[24]。在铁死亡过程中，对细胞铁平衡的维持起重要作用[25]。相关研究表明，在膀胱癌[26]、肝癌[27]细胞中FTH1下调表达，诱导铁死亡，抑制癌症发展。xCT是一种氨基酸转运蛋白，可被还原为半胱氨酸，用于谷胱甘肽的合成。通过抑制xCT，减少谷胱甘肽合成，是诱导肿瘤细胞铁死亡的有效途径[28]。有研究证明，在胃癌[29]、乳腺癌[30]细胞中，下调xCT的表达可以诱导肿瘤细胞发生铁死亡。在本研究中，经Garcinone C处理鼻咽癌细胞，FTH1和xCT表达下调，提示Garcinone C可通过诱导鼻咽癌细胞发生铁死亡，抑制肿瘤发展。

综上所述，Garcinone C可逆转EMT过程，抑制鼻咽癌细胞HK1和HONE1的迁移和侵袭，并诱导其发生铁死亡，提示Garcinone C具有潜在的抗鼻咽癌作用，为鼻咽癌治疗药物的研发提供了候选化合物。