右美托咪定对癫痫大鼠海马神经元细胞凋亡与Toll样受体4/核因子κB信号通路的影响

雍 芳，狄政莉，贾晓涛，刘志勤，顾乃兵，郝敏锋，燕玉娥

(西安市中心医院神经内科，陕西 西安 710004)

癫痫是临床常见的一类神经系统疾病，是由于脑神经元异常和过度超同步化放电引起的大脑功能暂时性障碍性疾病[1-2]。癫痫发作能够造成大脑缺氧，长期反复发作癫痫可造成患者认知功能、记忆功能严重降低[3-4]。目前认为癫痫引起的认知和记忆功能减退与神经元细胞凋亡、氧化应激、炎性反应等因素有关[5]。右美托咪定是一种α2肾上腺能受体激动剂，目前被广泛应用于各种手术和侵入式检查中，发挥镇静和镇痛作用[6]。有研究[7-8]发现，右美托咪定具有良好的抗炎作用和器官保护作用，能够减轻心肌缺血-再灌注、肺缺血-再灌注损伤程度，减少相关细胞凋亡，对神经元有一定保护作用。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR-4)/核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路能够调节多种炎性因子和细胞凋亡相关因子表达[9]。本研究采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射制作大鼠癫痫模型，观察右美托咪定预处理对癫痫模型大鼠海马神经元细胞凋亡和TLR-4/NF-κB信号通路表达的影响，以期探讨右美托咪定在癫痫预防中的效果和机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择45只健康雄性SPF级SD大鼠，10～15周龄，平均(12.7±2.1)周龄，体重235～259 g，平均(245.5±9.6)g，均购自川北医学院，动物生产许可证：SCXK(川)2018-18。试验开始前适应性饲养1周，饲养室环境温度为22～25 ℃，相对湿度40%～70%，自然昼夜，分笼进行喂养，每笼5只，标准饲料喂养，自由进食、饮水。保持环境清洁、整洁。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂：盐酸右美托咪定注射液(国药准字H20130093)购自江苏恒瑞医药股份有限公司；肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)酶联免疫吸附法检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；蛋白质Marker购自New England Biolabs公司；兔抗大鼠NF-κB、磷酸化NF-κB(pNF-κB)、离子钙结合衔接分子1(Iba-1)、Toll样受体4(TLR-4)和β-actin单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；PVDF膜购自德国Millipore公司。

1.2.2 主要仪器：RT-6100 型酶标仪购自深圳雷杜生命科学股份有限公司；垂直电泳仪、Chemi DOC XRS凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 分组及给药:采用随机数字表法将大鼠分为A组、B组和C组，各15只。适应饲养1周后给予C组大鼠腹腔注射20 μg/kg右美托咪定，给予A组和B组大鼠腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液，均连续腹腔注射7 d。

1.3.2 动物模型建立:给药7 d后采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射法[4]建立癫痫大鼠模型。B、C组在大鼠清醒状态下给予腹腔注射127 mg/kg氯化锂溶液，18～22 h后给予腹腔注射1 mg/kg，30 min后给予腹腔注射30 mg/kg匹罗卡品。观察大鼠行为表现并进行Racine分级，反复Racine分级评价为Ⅳ级以上视为癫痫持续发作，若持续1 h以上则视为造模成功。若大鼠在注射匹罗卡品后30 min未出现癫痫发作，则每间隔10 min追加腹腔注射10 mg/kg匹罗卡品直至造模成功。一旦成功造模，立即腹腔注射10 mg/kg地西泮终止癫痫发作，若注射后15 min仍未能终止则追加腹腔注射10 mg/kg地西泮。A组大鼠予以注射等体积0.9%氯化钠溶液注射。

1.3.3 Morris水迷宫测试:建模成功饲养1周后进行Morris水迷宫测试。池内水温保持在22～26 ℃，加入少量奶粉形成浊液以混淆大鼠视线。将水池等分为4个象限，任意选定一个象限放置平台(直径15 cm，位于水下约2 cm)，实验前1 d将大鼠放入水迷宫中进行适应。①定位航行试验：为期5 d，将大鼠面向池壁分别从2个入水点放进水中，记录大鼠找到平台所用的时间，即逃避潜伏期，如果大鼠在2 min内没有找到平台，将逃避潜伏期记为120 s;②空间探索试验：第6天时撤去平台，将大鼠从任意一个入水点放入水中，记录60 s时间内大鼠穿越原平台所在位置的次数。

1.3.4 酶联免疫吸附法检测海马组织TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平:断头法处死大鼠，立即取脑组织，0.9%氯化钠溶液冲洗血迹，取少量海马组织准确称重，冰上制备海马组织匀浆，12 000 r/min离心10 min后分离上清液，检测其中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，所有样本均进行3次重复检测，以平均值作为最终结果。

1.3.5 海马神经元细胞凋亡检测:取海马组织经蛋白酶K消化处理1 h，磷酸盐缓冲液(pH 7.0)连续漂洗3次，每次5 min，经TUNEL染色后棕黄色或棕褐色为凋亡细胞，于200×倍下计数凋亡细胞数量，计算视野内凋亡细胞所占比例。

1.3.6 Western blot检测海马组织NF-κB、pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白表达:取50～100 mg海马组织准确称重后放入EP管中，加入RIPA裂解液在4 ℃充分匀浆，4 ℃下12 000 g离心10 min后留取上清液备用。采用BCA试剂盒检测上清液总蛋白浓度。根据总蛋白浓度取适量上清液进行SDS-PAGE电泳，80 V电泳40 min后转为110 V继续电泳70 min，电泳结束后转移至PVDF膜上，按照目标蛋白分子量大小切取条带，分别加入NF-κB、pNF-κB、Iba-1和TLR-4一抗，2 ℃过夜孵育。5%脱脂奶粉封闭1 h后加入二抗室温孵育2 h，ECL显色并曝光。采用Image J图像分析系统，以管家基因蛋白β-actin作为参比计算相对吸光度值。

2 结 果

2.1 三组大鼠造模后逃避潜伏期和平台穿越次数比较 三组大鼠第1～5 天的逃避潜伏期均呈现显著降低趋势(均P<0.05)。C组各时间点逃避潜伏期长于A组，短于B组(均P<0.05)。C组大鼠平台穿越次数少于A组，多于B组(均P<0.05)。见表1。

表1 三组大鼠逃避潜伏期和平台穿越次数比较

2.2 三组大鼠海马组织TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平比较 三组大鼠海马组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平比较差异有统计学意义(均P<0.05)。B组和C组大鼠海马组织TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著高于A组，C组大鼠各指标显著低于B组(均P<0.05)。见表2。

表2 三组大鼠海马组织TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平比较(pg/mg)

2.3 三组大鼠海马神经元细胞凋亡比例比较 C组大鼠海马神经元细胞凋亡比例显著高于A组，但显著低于B组(均P<0.05)，见表3。

表3 三组大鼠海马神经元细胞凋亡比例比较(%)

2.4 三组大鼠海马组织NF-κB、pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相对表达水平比较 三组大鼠海马组织pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相对表达水平比较差异有统计学意义(均P<0.05)，NF-κB蛋白相对表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。C组大鼠海马组织pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相对表达水平显著高于A组，但显著低于B组(均P<0.05)。见表4。

表4 三组大鼠海马组织NF-κB、pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相对表达水平比较

3 讨 论

在我国，癫痫已经成为仅次于脑血管疾病的第二大神经系统疾病，据统计我国现有癫痫患者约900万，人群总发病率高达7‰，每年新增癫痫发病病例高达22.39～22.8/10万[10-11]。癫痫发病和发作机制目前尚未完全清楚，但通过脑电图检查可以发现多数患者脑部神经存在异常生物放电现象。本研究采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射建立癫痫大鼠模型，该种模型与人类癫痫临床表现和机制相似度高，均可见神经元细胞损伤和凋亡，胶质细胞增生、激活等病理变化。本研究在建模后1周对各组大鼠进行Morris水迷宫测试，结果表明，C组各时间点逃避潜伏期显著长于A组，但显著短于B组，C组大鼠平台穿越次数显著少于A组，但多于B组。提示相较于正常大鼠，模型大鼠均表现出认知功能和记忆功能减退，经右美托咪定预处理能够显著改善认知和记忆功能。

炎性反应是癫痫患者认知功能损伤发生的重要病理和生理基础，目前研究均发现当发生癫痫后，机体外周血促炎细胞因子和炎性介质表达迅速增加，加重神经损伤程度[12-13]。在造模前给予右美托咪定能够显著降低造模后海马组织中TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平。右美托咪定能够高特异性地结合中枢神经突触前膜α2肾上腺能受体抑制去甲肾上腺素(NE)释放，进而减轻手术引起的应激、损伤，保持血流动力学稳定，右美托咪定具有良好的抗炎和抗氧化作用[14-15]，而癫痫发作损伤认知和记忆功能的可能机制就包括氧化应激、炎症因子的作用，已经发现右美托咪定对肝、肾等多个重要脏器损伤具有明显的保护作用。

癫痫发作后炎症因子的表达和释放与海马区星形胶质细胞、小胶质细胞活化密切相关，癫痫发作可刺激小胶质细胞活化，启动TLR-4/NF-κB信号通路，继而快速表达和释放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子[16-17]。TLR-4是机体监视和识别病原体相关分子模式并启动天然免疫反应的重要分子，研究发现癫痫发作后，小胶质细胞内的病原体识别受体释放并被TLR-4识别，激活TLR-4/NF-κB信号通路，并通过级联放大效应引起炎症因子的释放[18]。本研究采用Western blot技术检测了三组大鼠海马组织中TLR-4/NF-κB信号通路中关键蛋白的表达情况，结果发现三组大鼠海马组织pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相对表达水平比较有统计学差异，NF-κB蛋白相对表达水平无统计学差异。C组大鼠海马组织pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相对表达水平显著高于A组，但显著低于B组。pNF-κB是NF-κB的磷酸化形式，也是其活化的标志，TLR-4能够增强NF-κB磷酸化[19]。Iba-1是小胶质细胞活化的标志物[20]。本研究结果提示癫痫发作引起TLR-4表达上调，促进NF-κB磷酸化，pNF-κB表达上调，星形胶质细胞和小胶质细胞活化，进而引起神经炎症损害和细胞凋亡。同时本研究还发现，C组大鼠海马神经元凋亡比例显著高于A组，但显著低于B组，提示右美托咪定能够通过抑制TLR-4表达和NF-κB磷酸化，减少星形胶质细胞和小胶质细胞活化引起的炎性因子表达和释放，减轻神经炎性损伤，减少海马神经元细胞凋亡。

综上，右美托咪定不仅可以通过激活TLR-4/NF-κB信号通路抑制癫痫大鼠海马神经元的炎性反应，还可以通过激活TLR-4/NF-κB信号通路下调炎症因子表达进而抑制癫痫大鼠海马神经元细胞的凋亡，从而改善神经功能，发挥神经保护作用。