姜黄素通过调控NLRP3/Caspase-1信号通路改善脑缺血大鼠神经功能障碍*

张忠胜，黄晓敏，邓小凤

广州医科大学附属第六医院，清远市人民医院 广东清远 511518

急性脑梗死是最常见的急性脑血管病，死亡率和致残率高。研究表明，炎症是缺血后脑损伤的重要原因之一，因此，抗炎治疗已成为缺血性脑损伤的一个新的治疗方向。已有研究显示，通过减少脑梗死大鼠脑组织中炎症因子的含量及阻断炎症小体的激活，可以减少缺血脑组织细胞凋亡，促进大鼠的神经功能恢复[1-3]。姜黄素（curcumin）是从姜科姜黄属植物的根茎中提取的一种植物多酚，是姜黄根茎的主要生物活性成分，具有抗病毒、抗纤维化、抗凝和葡萄糖调节功能等多种作用。姜黄素通过抑制 NF-κB和NLRP3炎症小体抑制小胶质细胞/巨噬细胞焦亡来改善缺血性卒中小鼠模型的脑白质损伤[4]，而且，姜黄素在体内外均能促进神经元存活，发挥抗缺血损伤的作用[5-6]，以上研究均提示姜黄素对缺血性脑损伤具有神经保护作用。本实验的目的是研究姜黄素治疗对局灶性大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型的影响，并分析其潜在作用机制。

材料与方法

1 动物

SPF级健康雄性SD大鼠24只，体质量250～300g，由杭州医学院提供，合格证号SCXK（浙）2019-0002。大鼠在20℃～22℃恒温动物房中饲养，湿度（60±10）%，12h光照与12h黑暗交替，大鼠自由进食及饮水，造模前适应性饲养1周。

2 药物与试剂

姜黄素（Sigma-Aldrich公司，批号PHR2209-50MG）；大鼠MCAO线栓（广州佳灵生物技术有限公司，批号3600aaa）；2，3，5-三苯基氯化四氮唑溶液（Sigma-Aldrich公司，批号17779）；超敏化学发光检测试剂盒（百赛生物，批号S6009M）；大鼠IL-1βELISA Kit（合肥莱尔生物科技，批号LE-B1145）；大鼠IL-18 ELISA Kit（合肥莱尔生物科技，批号LEB0380）；大 鼠NLRP3 ELISA Kit（Abcam公 司，批号ab277086）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司，批号23209）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，批号MA0159）；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）（碧云天公司，批号P0015L）；HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（proteintech，批 号SA00001-1）；HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（proteintech，批 号SA00001-2）；TNF-a抗体（ImmunoWay，批号YT4689）Caspase-1抗体（proteintech，批号22915-1-AP）；P-caspase-1（Affinity，批号AF5438）；GAPDH（proteintech，批号60004-IIg）。

3 仪器

体视显微镜（上海永科公司，YKT-5300）；超低温冷冻储存箱（中科美菱，DW-HL340）；移液器（德国eppendorf，L10577G）；离心机（中国白洋，B320A）；微量冷冻离心机（贝克曼，Microfuge-22R）；数显恒温水浴锅（上海邦西仪器科技有限公司，HH-52）；蛋白垂直电泳仪（美国BIO-RAD公司，POWER PAC 200）；轨道式摇床（杭州米欧仪器有限公司，GS-20）；化学发光成像系统（美国BIO-RAD公司，ChemiDoc Touch）；酶 标仪（美国BIO-RAD公司，680型号）；电子分析天平（赛多利斯，BS224S）；磁力搅拌器（MYP13-2S，上海梅颖浦仪器公司）

4 造模与给药

SD大鼠于室温下适应性饲养1周，根据随机数字表法将24只SD大鼠随机分为3组：假手术组（Sham组），MCAO大鼠模型组（MCAO组）和姜黄素干预组（CUR组），每组8只。Sham组大鼠颈内动脉仅被隔离，但不插入尼龙缝线栓塞大脑中动脉。模型制备参考改良Zea-Longa线栓法[7]。缺血60min后拔出线栓，模型建立后即刻对大鼠进行腹腔注射1次姜黄素（100mg/kg），随后连续6天每日接受腹腔注射1次（100mg/kg），假手术组和模型组组在相同时间点腹腔注射等量生理盐水；建模后第14d将各组大鼠处死取脑。

5 神经功能评分

采用Longa 评分法对大鼠进行神经功能评分[7]，评分在2～3分的大鼠被纳入实验。0分：没有神经损伤的症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：大鼠向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自行行走，失去意识。在造模后第1d、7d、14d对各组大鼠进行神经功能评分。

6 TTC 染色法测定各组大鼠脑梗死体积

将大鼠断头取脑后用盐水洗涤，将脑组织在-20℃冷冻20min，制作厚度2mm的脑组织冠状切片，在37℃温度下用2%TTC染色30min，随后用4%甲醛溶液固定。OLYMPUS数码相机采集图像，使用Image-proplus 6.0软件分析图片，计算病灶侧脑梗死体积及与总体积的百分比（病灶侧梗死体积=梗死面积×脑片厚度。梗死体积百分比=（病灶侧梗死体积/对侧半球体积）×100%）。

7 ELISA法检测大鼠脑组织中IL-18、IL1β及NLRP3含量

于造模后第14d处死大鼠，断头取脑，冲洗称重。称量后制备脑组织匀浆。按照各试剂盒说明书操作进行，通过ELISA法测定脑组织匀浆中IL-18、IL1β及NLRP3含量。

8 Western blot法检 测TNF-α、Caspase-1及P-Caspase-1表达

造模14d后，用10%水合氯醛麻醉处死大鼠，断头取脑，取脑梗死组织加PBS研磨，用预冷的组织裂解液提取脑组织总蛋白，Bradford法测定样品蛋白含量。蛋白变性、上样，十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1 h，湿法转膜45 min。脱脂奶粉封闭2 h，洗膜后与稀释的TNF-α、Caspase-1及P-Caspase-1一抗溶液孵育，4℃摇床过夜；洗涤，加入二抗溶液室温下孵育1 h。膜上滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件分析各抗体条带灰度值。

9 统计学处理

结 果

1 大鼠神经功能评分

与Sham组相比，MCAO组和CUR治疗组大鼠在造模1d、7d、14d神经功能评分显著升高（P＜0.05）；与MCAO组相比，CUR治疗组大鼠神经功能评分在造模1d、7d无显著变化（P＞0.05），在造模14d神经功能评分显著降低（P＜0.05）。见表1。

表1 不同组别大鼠神经功能评分（±s）

表1 不同组别大鼠神经功能评分（±s）

注：与Sham组比较*P＜0.05，与MCAO组比较#P＜0.05

组别 造模前 神经功能评分造模后1d 造模后7d 造模后14d Sham组 0 0 0 0 MCAO组 0 2.83±0.41* 2±0* 1.5±0.55*CUR组 0 2.67+0.52* 1.83±0.41* 0.83±0.41*#

2 TTC染色计算大鼠脑梗死体积

通过TTC染液对各组大鼠脑组织进行染色。结果如图1所示：Sham组大鼠脑切片TTC染色未见梗死灶出现； CUR组为（27.75±3.44）%，低于MCAO组的（39.05±3.54）%，差异有显著性（P＜0.05）。见图1，图2。

图1 TTC染色法比较不同组别大鼠脑梗死体积

图2 不同组别大鼠脑梗死体积比较

3 大鼠脑组织中IL-18、IL1β及NLRP3含量

按照试剂盒说明书进行含量测定，通过ELISA检测的方法对各组大鼠脑组织检测，检测结果如表2所示。与假Sham相比，MCAO组IL-18、IL-1β、NLRP3的含量明显上升（P＜0.05）；与MCAO组相比，CUR治疗组IL-18、IL-1β、NLRP3的含量降低，比较差异有显著性（P＜0.05）。见表2。

表2 不同组别大鼠脑组织IL-18、IL-1β、NLRP3含量（pg/mL-1）

4 大鼠脑组织TNF-α、Caspase-1及其磷酸化表达

通过WB检测方法对各组大鼠脑组织检测，检测结果如图3、图4、图5所示，与Sham组相比，MCAO组脑组织中TNF-α、caspase-1、P-caspase-1的蛋白表达水平明显上升（P＜0.05）；与MCAO组相比，CUR组中TNF-α、caspase-1、P-caspase-1的蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。

图3 不同组别大鼠脑组织IL-18、IL-1β、NLRP3含量比较

图4 不同组别大鼠脑组织TNF-α、Caspase-1、P- Caspase-1表达水平（Western-Blot）

图5 不同组别大鼠脑组织TNF-α、Caspase-1、PCaspase-1表达水平比较

讨 论

急性脑梗死是最常见的脑卒中类型，当前研究表明，急性脑梗死会导致神经元细胞死亡和损伤相关分子模式（DAMP）等因子的释放，这些因子会在受损伤的大脑区域立即引发局部炎症[8]，通过加剧血脑屏障损伤、微血管衰竭、脑水肿、氧化应激和直接诱导神经元细胞死亡而加重继发性脑损伤。除了局限于受损大脑区域的炎症外，中风后的炎症反应也会发生并持续整个大脑，影响患者的长期预后[9]。因此，炎症在脑卒中的发病机制中扮演着重要角色，抗炎治疗对卒中防治具有重要意义[10-11]。

肿瘤坏死因子α（TNF-α）具有炎症和代谢作用。Lin等发现[12]，使用TNF-α受体抑制剂R-7050预处理永久性脑缺血大鼠模型，可以减轻卒中后大鼠的神经功能缺损、脑梗塞、脑水肿及氧化应激水平，这提示降低TNF-α水平对脑缺血损伤有保护作用。NLRP3（含NOD-、LRR-和pyrin结构域的蛋白质3）是一种细胞内传感器，可检测多种微生物、内源性危险信号和环境刺激物，从而导致NLRP3炎症小体的形成和激活，NLRP3可以介导caspase-1激活，调控下游炎症因子IL-1β/IL-18 等的释放[13-14]，Zhang等[15]研究表明，重组骨桥蛋白可以减少缺血性梗死面积并减轻大鼠脑缺血性损伤，这可能与其有效参与抑制炎症小体和小胶质细胞炎症激活有关。胡兴等[16]发现，NLRP3炎症小体信号通路在缺血缺氧性脑损伤新生大鼠海马组织中表达增高，可能导致缺血缺氧性脑损伤新生大鼠神经细胞死亡。Zhu等[17]和Li等[18]研究发现，降低NLRP3炎症小体的激活，可以改善缺血性中风模型小鼠的神经功能评分，减少脑梗死面积并改善脑水肿。以上研究说明，抑制NLRP3炎症小体及其下游分子，可能是未来神经保护治疗的潜在靶点。

姜黄素是姜黄中的一种多酚，据报道具有抗氧化、抗炎、保肝、抗动脉粥样硬化和抗糖尿病等特性[19-21]。近年来，姜黄素应用在神经系统领域的研究日益增多，包括阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、亨廷顿病、朊病毒病、中风、肌萎缩侧索硬化症等疾病[22-25]。在本研究中，我们使用大脑中动脉闭塞方法建立了大鼠局灶性脑缺血模型，并用姜黄素对其进行干预。采用神经功能评分法、TTC染色法、酶联免疫吸附法和Western blot法研究姜黄素对大鼠神经功能、脑缺血损伤、炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α、caspase-1以及炎性小体NLRP3表达的影响。结果显示，与缺血模型组相比，姜黄素可以改善大鼠神经功能评分，减少脑梗死体积，显著降低大鼠梗死脑组织中IL-1β、IL-18、TNF-α水平，提示姜黄素很可能通过抑制炎症反应，减轻大脑炎症损伤。而IL-1β、IL-18的释放是caspase-1依赖性的，需要经过caspase-1的剪切活化。而NLRP3/Caspase-1是IL-1β、IL-18等炎症因子的上游通路，阻断NLRP3/Caspase-1信号通路，可以减轻炎症因子合成与释放，减轻组织炎症损伤与细胞凋亡[26-28]。本研究显示，脑缺血模型组大鼠脑组织中NLRP3、Caspase-1的蛋白表达显著增高，姜黄素治疗组NLRP3、Caspase-1显著下降，推测姜黄素通过抑制NLRP3/Caspase-1信号通路，减少IL-1β、IL-18的释放。

我们的研究表明，姜黄素可以减少大鼠脑梗死面积并改善神经功能，这可能与其减轻炎症反应有关，其抗炎机制可能与姜黄素阻断NLRP3/Caspase-1信号轴，抑制NLRP3炎症小体的功能，减少炎症因子的合成与释放有关。