mRNA 疫苗技术和产业发展概况

刘财旺

玉溪沃森生物技术有限公司

龙新华

玉溪沃森生物技术有限公司

包嫄

云南沃森生物技术股份有限公司

李薇*

云南沃森生物技术股份有限公司

1989年，有研究者发现在脂质包裹下mRNA 可以在真核细胞内转染和表达，mRNA 作为药物的概念被提出[1]。1990年，研究者成功完成了体外转录mRNA 在小鼠体内的表达，证明了mRNA作为药物的可行性[2]。1995年，又有研究者用小鼠模型开发了第一种编码癌胚抗原（CEA）的mRNA 肿瘤疫苗，证明mRNA疫苗在肿瘤治疗领域具有较好前景[3]。然而，由于mRNA 稳定性差、先天免疫原性高、体内递送效率低下，mRNA 药物开发在很长一段时间内受到限制[4]。近年来，mRNA 修饰技术和递送技术不断进步。2005年有研究者发现使用修饰尿苷合成的mRNA可以避免被免疫系统识别和降解，有效解决了mRNA 在体内的不稳定性和高免疫原性问题；非翻译区的优化和poly（A）尾优化技术提高了mRNA 的稳定性和翻译效率；纯化方法的改进有效去除了双链RNA 杂质，从而减少先天免疫的非特异性激活；通过将mRNA 配制成纳米颗粒，如脂质纳米颗粒（LNP）、聚合物纳米颗粒和脂质-聚合物杂化纳米颗粒，mRNA 技术逐渐成为传染病和肿瘤防治领域的焦点[4-17]。2023年诺贝尔生理学或医学奖授予了科学家Katalin Karikó 和Drew Weissman，以表彰他们在核苷碱基修饰方面的发现，推动了mRNA 疫苗在抗击COVID-19大流行过程中发挥巨大作用；同时，mRNA 疫苗也在此期间取得了快速发展[12,18-21]。mRNA 药物技术开发过程中的部分关键节点见图1[22]。

图1 mRNA 药物技术开发过程部分关键节点[22]

1 mRNA 疫苗简介

1.1 mRNA疫苗的作用机制

如图2 所示，接种mRNA疫苗后，体外转录（IVT）mRNA 通过递送载体进入靶细胞的细胞质中，通过靶细胞的表达系统合成具有特定药理活性的抗原蛋白，翻译的抗原蛋白被蛋白酶降解为抗原肽，然后被转运到内质网中，并通过主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ途径呈递给CD8+T 细胞，以诱导细胞介导的免疫反应。部分抗原蛋白由宿主细胞分泌并被附近的抗原呈递细胞（APC）吸收，通过MHC Ⅱ途径呈递给抗原特异性CD4+T细胞，分泌细胞因子引发细胞免疫反应，并激活B 细胞产生抗体。抗原蛋白也可以通过一种交叉呈递的机制被处理，并通过MHCⅠ途径激活抗原特异性CD8+T细胞，从而杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞，以达到预防和治疗疾病的目的[16,23-27]。

图2 mRNA 疫苗作用机制示意图[28]

1.2 mRNA 疫苗的结构

目前用于疫苗研究的mRNA主要有3 种类型：非复制mRNA、自扩增RNA（saRNA）和环状RNA（circRNA）。其中，非复制mRNA 最为常用。环状mRNA 模仿了病毒感染过程，其复制机制可以大幅降低疫苗剂量；环状mRNA 的闭环结构保护其免受核酸外切酶降解，稳定性更好。mRNA 含有几个必要的结构，包括帽子结构（Cap）、5'非翻译区（5'UTR）、编码抗原蛋白的开放阅读框（ORF）、3'非翻译区（3'UTR）和poly（A）尾结构。自扩增mRNA 疫苗的开放阅读框还包括编码细胞内RNA 扩增所需的非结构蛋白，环状mRNA 则是一个没有5'UTR 和3'UTR 的闭环结构[29]。不同类型mRNA的结构和翻译过程见图3。

图3 不同类型mRNA 的结构和翻译过程[29]

如前文所述，mRNA 疫苗必须被输送到人体的靶细胞才能引发免疫反应，但是mRNA 进入人体后很容易被核酸酶降解，且难以透过细胞膜屏障到达细胞质，因此mRNA 疫苗还需要合适的递送载体。另外，mRNA 疫苗通常需要冷冻储存，需要冷冻保护剂保护递送系统不被破坏。因此，mRNA 疫苗的主要组成部分包括编码抗原蛋白的mRNA，用于包埋、递送mRNA 的脂质载体（最常用的是LNP），缓冲溶液（如PBS buffer 或Tris buffer），冷冻保护剂（如蔗糖）。以新冠mRNA 疫苗为例，辉瑞（Pfizer）与BioNTech 公司合作开发的BNT162b2 以及莫德纳公司开发的mRNA-1273 这两款疫苗的结构组成见图4。

图4 新冠mRNA 疫苗BNT162b2 和mRNA-1273 的结构组成[30]

其中，mRNA 制剂依靠阳离子脂质在低pH 环境下有效地复合带负电荷的mRNA，形成LNP 的核心[31-33]。磷脂在LNP中发挥结构作用，有助于脂质双分子层的形成和破坏，以促进内体逃逸[34-35]。胆固醇在LNP 中起稳定作用，在细胞转染中至关重要[36-37]。聚乙二醇（PEG）脂质在LNP 表面充当屏障，在空间上稳定LNP 并减少与蛋白的非特异性结合[38]。

1.3 mRNA疫苗生产方式

基于目的mRNA 的特性及临床应用，其合成方式主要有化学合成、重组生产、酶法合成等，其中体外转录（酶法）被认为是大规模生产mRNA 金标准[39]。mRNA 疫苗制备流程如图5 所示，在上游，疫苗靶序列被导入质粒中，DNA 模板被生成、扩增、纯化和线性化；在中游，使用T7 RNA 聚合酶在体外转录反应后合成RNA，并使用5'帽类似物共转录（或转录后加帽）实现RNA的5'加帽，再通过纯化得到高纯度的mRNA；在下游，将获得的高纯度mRNA 配制在LNP 中，并装入小瓶或容器中，用于大规模接种或使用[5,40-41]。

图5 mRNA 疫苗制备流程[42]

上述方法几乎适用于生产任何mRNA 序列，批次间变异性低，与其他平台相比，有助于节省时间并降低经济成本。对mRNA原料药和制剂药物产品进行测试和过程分析，以评估鉴别、外观、含量、纯度、RNA 完整性、残留DNA、包封率、粒径、生物活性内毒素污染和无菌性[5,43]。对于特定的mRNA，制备mRNA 药物的程序可能会稍作调整，包括修饰核苷，以及采用加帽策略或纯化策略等。

生产mRNA 所需的所有设备均符合良好生产规范（GMP）级别，在有限的工业规模的生产设施内，每年可生产数千万剂基于RNA 的产品[5]。

1.4 mRNA 疫苗优势

首先，mRNA 疫苗是一种无感染、安全的平台，没有感染或插入基因组突变的潜在风险性[11,44]。其次，mRNA 体内半衰期可以通过使用mRNA 修饰和递送方法来调节[45]。再次，mRNA 疫苗允许同时递送多种抗原，特别是对于肿瘤疫苗，可以覆盖各种肿瘤相关抗原（TAA）、肿瘤特异性抗原（TSA）或细胞因子，以引发体液和细胞介导的免疫反应，从而增强抗肿瘤功效[46]。最后，如前文所述，mRNA 疫苗具有可扩展性，可以通过无细胞的体外转录（IVT）获得高产量的mRNA，且一旦建立了成熟的mRNA 疫苗平台，就可以通过该平台快速开发不同的mRNA 疫苗。

2 mRNA 疫苗产业发展状况

2.1 mRNA疫苗研发进展

目前，大量mRNA 疫苗正在研制中，部分已应用于临床治疗各种疾病，包括新冠mRNA 疫苗、其他传染病mRNA 疫苗和肿瘤mRNA 疫苗。此外，mRNA 疫苗也会与其他疗法（如化学疗法和免疫疗法）联合使用。

2.1.1 新冠mRNA 疫苗

新冠病毒（SARS-CoV-2）感染引起的COVID-19 大流行仍在持续，对人类健康和全球经济造成巨大影响，疫苗是抗击COVID-19 大流行的主要途径。2023年1月24日世界卫生组织发布的数据显示，全球有300 多种新冠候选疫苗，其中176 种已进入临床试验阶段。基于mRNA疫苗在预防传染病方面的优势，新冠mRNA 疫苗在COVID-19大流行期间得以快速开发及迭代，并为抗击COVID-19 作出了重要贡献。辉瑞/BioNTech 公司联合开发的BNT162b2（Comirnaty）于2020年12月在美国获得紧急使用授权（EUA），其生物制品许可证申请（BLA）亦于2021年8月在美国获批，是全球第一个上市的mRNA 疫苗；莫德纳（Moderna）公司的mRNA-1273（Spikevax）于2020年12月在美国获得EUA，BLA 于2022年2月1日在美国获批，是全球第二个上市的mRNA 疫苗；我国军事医学科学院、苏州艾博生物和云南沃森生物共同研发 的AWcorna 于2022年9月在印度尼西亚获得EUA，这也是我国在海外获得的第一个EUA；石药集团的SYS6006 于2023年3月在我国获得EUA，为国内首款[47]。部分针对COVID-19的代表性mRNA 疫苗见表1。

莫德纳公司的mRNA-1273 和辉瑞/BioNTech 公司的BNT162b2 均于2020年1月开始研发，并在12 个月内获得EUA，目前仍在全球范围内使用，证明了mRNA 疫苗预防病毒感染的有效性。临床结果表明，BNT162b2 和mRNA-1273 都可以诱导产生高水平的中和抗体，并引发强大的T 辅助因子1 细胞反应，因此在预防野生型病毒感染方面具有较好的效果（～95% ）[30]。

COVID-19 暴发以来，参考SARS-CoV-2序列（hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019）观察到超过12 000 个突变，大约每11 天发生一次核苷酸替换[48-49]。SARS-CoV-2 的特定突变引发不同的表型改变，其中一些由于可能导致病毒的传播性或毒力增强，通过自然感染或疫苗接种获得的中和抗体减少，使治疗或疫苗接种的有效性降低，被归为关注变体（VOC）[50-51]。截至目前，已经确定了5 种VOC，包括 Alpha、Beta、Gamma、Delta 和Omicron 变体[51]。莫德纳公司的mRNA-1273 和辉瑞/BioNTech 公司的BNT162b2对于上述5 种VOC 的保护效果均出现了不同程度的下降，尤其是对于突变位点达30 多个的Omicron 变体的保护效果下降更为显著[52]。目前，已有多种针对SARS-CoV-2 VOC，尤其是Omicron 变体的mRNA 疫苗正在开发中，包括云南沃森生物与上海蓝鹊生物合作开发的RQ3013、RQ3033 疫苗，并有数种已被授权使用[51-53]。

2.1.2 其他传染病mRNA疫苗

基于mRNA 疫苗在传染病预防方面的优势以及在COVID-19预防中取得的效果，近年来，预防其他传染病病毒[如流感病毒、寨卡病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、带状疱疹病毒]的mRNA 疫苗也成为研发热点，且部分已进入临床试验阶段（表2）。其中，莫德纳公司研发的针对巨细胞病毒（CMV）的mRNA-1647、针 对RSV 的mRNA-1345 以及针对流感病毒的mRNA-1010 进度较快[29]。

表2 部分临床试验阶段的传染病预防mRNA 疫苗[29]

2.1.3 肿瘤mRNA 疫苗

基于可编码多种肿瘤抗原、安全给药和诱导强大T 细胞反应的高免疫原性等优点，mRNA疫苗已成为一种越来越受欢迎的肿瘤治疗方法。肿瘤疫苗的开发主要针对TAA 和TSA。其中，TAA 是由正常基因翻译而来的蛋白质，在肿瘤细胞表面异常或过度表达，但同时也存在于正常组织中，特异性较低。TSA 在正常组织中不存在，但在个体肿瘤细胞中表达，具有高度特异性，因此被认为是理想的肿瘤疫苗抗原。目前，肿瘤mRNA 疫苗大多仍处于Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段（表3）[29,54-55]。

表3 部分临床试验阶段的肿瘤mRNA 疫苗[29]

2.2 mRNA 疫苗的GMP生产

2.2.1 国内外对于mRNA疫苗GMP 生产的要求及差异

我国对疫苗生产实施严格的准入制度，疫苗上市许可持有人自身应当具备疫苗生产能力，一般情况下不允许委托生产。因此，在我国预防用mRNA 疫苗上市许可持有人必须自建GMP 生产线，具备生产和检验放行的能力；但若不是预防用mRNA 疫苗，则不受此限制，可以委托生产。国外药品监管机构对于自建生产线无具体限制要求。因此，我国mRNA 疫苗企业普遍选择自建生产线；而国外相关企业更多的是基于企业自身发展战略选择自建生产线、与其他企业合作或委托生产。

预防传染病用mRNA 疫苗的质粒DNA（pDNA）是否能委托生产，也是一个值得关注的问题。欧盟相关指南（Questions and Answers on the Principles of GMP for the Manufacturing of Starting Materials of Biologicalorigin Used to Transfer Genetic Material for the Manufacturing of ATMPs）把pDNA 作为起始物料进行监管，允许企业委托医药合同生产组织（contract manufacture organization，CMO）生产pDNA。在我国，根据《疫苗管理法》《新型冠状病毒预防用疫苗研发技术指导原则（试行）》等相关规定，pDNA 模板定义为原液的生产工艺，企业应当自主生产pDNA[47]。

2.2.2 国内外mRNA 疫苗GMP 生产基地概况

疫苗生产必须通过GMP 符合性检查，每个工厂都必须具备符合资质要求的人员和基础设施，因此大规模集中生产是mRNA 疫苗生产现状。基于国内外疫苗监管要求的差异，国外mRNA 疫苗企业主要通过与有生产能力的企业合作或委托生产，以快速扩大产能，同时启动新建生产基地，可能用于生产质粒、mRNA 原液、LNP（DP ）或者进行灌装和分发；而我国的大部分mRNA 疫苗企业在项目早期就启动建设GMP 生产基地，大多涵盖从质粒生产到最终灌装和分发的功能。

莫德纳公司和辉瑞/BioNTech 公司的新冠mRNA疫苗生产工厂几乎都分布在欧美地区。为了更好地实现疫苗的全球供应，莫德纳公司、辉瑞/BioNTech 公司与包括我国、澳大利亚、加拿大、新加坡、南非和韩国在内的几个国家或地区的企业建立了合作关系，并在部分国家和地区布局了生产基地建设计划。

mRNA 疫苗企业三巨头之一CureVac，在德国总部拥有自己的GMP 级别临床样品生产车间和产业化工厂，其产业化工厂面积达8800m2，设计年产能为3000 万剂。此外，CureVac 还与诺华（Novartis）公司合作，计划在位于奥地利的工厂生产mRNA 原液和制剂，年产能可达2 亿剂[53]。

云南沃森生物是国内最早布局mRNA 疫苗产业化的企业，早在2021年9月就在云南省玉溪市高新区疫苗产业园建成mRNA疫苗模块化工厂，原液年产能可达10 亿剂，制剂产能可达2.4 亿剂。石药集团的SYS6006 由其子公司巨石生物负责生产，巨石生物的mRNA 生产厂房产能可达15 亿剂，其中新冠mRNA 疫苗10 亿剂。此外，国药中生复诺健位于上海嘉定的GMP 生产基地，设计最高年产能为20 亿剂；云顶新耀位于浙江嘉善的GMP 生产车间年产能预计可达7 亿剂次；启辰生生物在珠海金湾国际健康港的GMP 生产车间，建筑面积超1300m2，能实现全链条生产；还有成都威斯津位于成都天府国际生物城的在建生产基地，规划年产能1 亿剂；蓝鹊生物在上海宝山规划了10 000m2GMP 生产基地；康希诺在上海临港规划了约17 000m2生产厂房[53]。

现阶段，由于新冠疫苗的需求大幅下降，mRNA 生产基地的发展目标由快速扩大产能转变为与mRNA 疫苗企业自身战略相适应。基于mRNA 疫苗高度平台化的特点，这些生产基地可以迅速用于其他mRNA 疫苗的开发。

3 mRNA 疫苗供应链概况

3.1 国内外mRNA 疫苗供应链概况

随着新冠mRNA 疫苗的发展，基于传统生物药物的供应链，mRNA 疫苗供应链也愈发成熟。mRNA 疫苗供应链主要包括主要设备、原材料及关键耗材，其中比较关键的是酶、核苷酸底物、帽子结构类似物、脂质辅料、分离纯化设备与耗材、LNP 包封设备与质控设备等。

已上市的新冠mRNA 疫苗中，莫德纳公司的mRNA-1273 和辉瑞/BioNTech 公司的BNT162b2 的原材料成本占比分别为55.9% 和 41.7%（表4），可见原材料在mRNA 疫苗生产中的重要性。其中，帽子结构类似物（46%）、酶类（约30%）占据了大部分原材料成本（表5）[47]。

表4 新冠mRNA 疫苗mRNA-1273（莫德纳公司）和BNT162b2（辉瑞/BioNTech 公司）的生产成本分布情况[47]

表5 新冠mRNA 疫苗mRNA-1273（莫德纳公司）和BNT162b2（辉瑞/BioNTech 公司）的原材料成本分布情况[47]

mRNA 疫苗生产各关键链点的主要供应商详见表6。从表中可以看出，mRNA 疫苗生产所需原材料和设备等已基本实现国产替代，进步巨大。部分原辅料和耗材由于生产工艺和质量的局限性和稳定性，目前仍难以实现国产替代。尤其是mRNA 合成纯化及后续制剂工艺中的关键耗材，由于色谱填料和中空纤维柱等生产用高值耗材研发周期较长，且涉及材料学、流体动力学、工程力学及精细化工等多学科交叉，尚存在国产化水平较低、产品质量有待提高等情况；基于对检测仪器的高精度要求，大部分检验仪器仍依赖进口。另外，递送系统、核苷酸修饰、帽子结构类似物、LNP 制备设备还存在一些专利问题。因此，为了实现国产mRNA疫苗的国际化，开发具有自主知识产权的国产物料将成为未来我国mRNA 疫苗产业化的重点之一。

表6 mRNA 疫苗生产各关键链点的主要供应商[47]

许多国内mRNA 疫苗研发企业出于降低供应链风险的考虑，正积极开展关键原材料的国产化替代研究工作，如对限制性内切酶（Bsa Ⅰ）、DNA 核酸酶（DNase Ⅰ）开展了全面的质量标准和工艺对比研究。结果表明，国产物料质量标准在一定程度上比进口物料的质量标准更加完善；对于同一物料，国产供应商和进口供应商来源对产品质量的影响无明显差异。

目前，从mRNA 疫苗物料供应商调研和审计情况来看，大部分原辅料均可实现国产替代。极少部分原辅料的纯度对于LNP结构稳定非常重要，国产物料纯度尚不能满足产品工艺质量需求，仍然采用进口物料。

4 总结与展望

mRNA 疫苗因具有灵活、安全、可调控以及快速开发等特点，成为生物制药领域的一颗冉冉升起的新星。其不仅在抗击COVID-19 大流行中发挥了巨大作用，也将在肿瘤免疫和传染病领域成为应用热点。相关研产管线及供应链也将更加成熟，同时已建成或在建的平台化mRNA 疫苗研产管线将推动mRNA 疫苗产业高速发展。此外，个体化医疗也有望成为mRNA 疫苗研产管线布局的重要方向之一。但需要关注的是，目前mRNA 疫苗生产成本尤其是原材料成本仍较高，降低原材料成本可大大提高疫苗的产品可及性。开发自扩增RNA（saRNA）疫苗以降低mRNA疫苗的剂量要求可能是前景较好的方法之一，另外也有报道采用类似重组蛋白的方式基于细菌/细胞系统生产mRNA，从而在保证mRNA 疫苗质量的同时有效降低生产成本。目前，mRNA 疫苗的专利壁垒仍较多，为了实现国产mRNA 疫苗的国际化，具有自主知识产权的国产物料的开发力度需要进一步加强。