代谢工程改造微生物固定二氧化碳研究进展

陶雨萱，郭亮，高聪，宋伟，陈修来

（1 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2 江南大学生命科学与健康工程学院，江苏 无锡 214122）

在过去的4万年中，大气中的二氧化碳（CO2）浓度始终稳定在200～280μL/L，而随着石化燃料使用量的急剧增加，在近50年内，CO2浓度猛增到414μL/L，未来将会导致约24%的动植物灭绝[1−2]。因此，在控制CO2排放的基础上，还需从大气中去除CO2以减轻气候变化造成的破坏性影响[3]。除了天然的植物封存外，多年来研究者们致力于采用物理、化学等多种手段以实现CO2的捕集和利用。例如，改造现有发电厂的后燃技术[4]、用于燃料预处理的一体化气化联合循环技术[5]和CO2膜分离技术[6]等。但是，由于CO2捕集设备安装成本较高、CO2封存运输过程复杂、部分设施运行效率低下等问题，使得传统CO2捕集与封存技术在实际应用过程中存在困难[7]。

微生物CO2固定是促进碳利用与减排的新思路，主要侧重于CO2固定酶的挖掘与改造、CO2固定路径的探索与优化以及CO2固定微生物的进化与设计，为实现“碳达峰、碳中和”的国家重大战略目标提供技术支撑。微生物CO2固定技术不仅具有污染小、成本低、能源消耗少等优点，而且可以绿色合成高价值化学品，包括生物柴油、生物塑料和生物医药等。目前，对于CO2固定酶的研究已经从天然CO2固定酶的挖掘与强化逐渐发展为CO2固定人工酶的从头设计与理性改造。例如，通过在光合作用生物Synechocystissp. PCC 6803中过量表达卡尔文（CBB）循环路径关键酶——1,5−二磷酸核酮糖羧化酶（RuBisCo），有效增强了Synechocystissp.的CO2固定效率，提高了乙醇的产量[8]。而在异养微生物大肠杆菌（Escherichia coli）中过量表达来自产琥珀酸曼氏杆菌（Mannheimia succiniciproducens）的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧激酶（PECP）后，成功提高羧化反应效率与苹果酸的生产强度[9]。对于CO2固定途径的研究，已经从天然CO2固定途径的挖掘与表达优化，逐渐发展为人工CO2固定途径的从头设计、合成与应用。目前，天然CO2固定途径主要包括CBB 循环、还原三羧酸（RTCA）途径和3−羟基丙酸（3−HP）双循环等，人工CO2固定途径主要包括巴豆酰辅酶A/乙基丙二酰辅酶A/羟基丁酰辅酶A（CETCH）循环、丙酮酸羧化酶（Pyc）−草酰乙酸乙酰水解酶（Oah）−乙酸辅酶A连接酶（Acs） −铁氧化还原蛋白氧化还原酶（Pfor）（POAP）循环和人工还原甘氨酸（rGly）途径等。对于CO2固定微生物的研究，已经从自养/异养微生物CO2固定的代谢改造，逐渐发展为异养人工微生物的固碳重构。例如，在E. coli中引入CBB循环，并借助定向进化策略，成功获得了以CO2为唯一碳源、甲酸为唯一能源的化能自养型E. coli。另外，采用类似的策略也成功获得了以CO2为唯一碳源、甲醇为唯一能源的化能自养型毕赤酵母（Pichia pastoris）[10]。

本综述围绕微生物固定CO2过程中的关键问题，从自养微生物、异养微生物和人工微生物三个方面，阐述了强化微生物CO2固定效率的代谢工程与合成生物学策略，并展望了微生物固定CO2的进一步发展与应用的方向。

1 自养微生物固定CO2

通过CO2固定获得的有机碳是有机化学品和能源物质的主要来源。地球上自养生物的总CO2固定能力可达每年3800 亿吨左右[11]。虽然自养微生物能够以CO2为唯一碳源进行生长，但是其生长速度相对缓慢且生产强度也较低，在工业上的应用仍然存在一定的限制。随着代谢工程与合成生物学的快速发展，可以通过挖掘、改造与优化天然CO2固定途径、增强自养微生物光合作用等策略来改善自养微生物的CO2固定能力。

1.1 天然CO2固定途径

目前，已经报道了6 种天然CO2固定途径（表1），分别是CBB循环、RTCA途径、3−HP双循环、Wood Ljungdah（WL）途径或还原乙酰辅酶A途径、对羟基丁酸二羧酸酯（DC−4HB）循环和3−羟基丙酸/4−羟基丁酸（3HP−4HB）循环（图1）。然而，自养微生物（包括光合微生物和非光合微生物）在利用天然CO2固定途径过程中存在催化效率低、能量损失大等问题。为了实现高效的CO2固定，需要挖掘催化效率高、能量需求小的新型天然CO2固定途径[12]。

图1 天然CO2固定途径

表1 天然CO2固定途径

1.1.1 光合微生物的CO2固定途径

光合微生物同化CO2的路径[图1(a)]主要有CBB循环、RTCA途径和3−HP双循环[19]。CBB循环为好氧途径，关键酶为RuBisCo[20]，每固定3mol CO2需消耗9mol ATP 与6mol NAD(P)H，产物为3−磷酸甘油醛[13]。RTCA途径在厌氧和微氧条件下均可运行，关键酶为2−酮戊二酸合成酶和ATP−柠檬酸裂解酶，每固定2mol CO2需消耗2mol ATP 与4mol NAD(P)H，产物为乙酰辅酶A[11,21]。3−HP 双循环是好氧循环，关键酶为丙酰辅酶A合成酶和丙二酰辅酶A还原酶，每固定3mol HCO−3需消耗5mol ATP与5mol NAD(P)H，产物为丙酮酸[15]。目前，研究人员虽然充分解析了光合微生物的CO2固定途径，但光合微生物仍然面临光能转化效率低、菌株生长缓慢等问题，从而限制了光合微生物的工业化应用进程。

1.1.2 非光合微生物的CO2固定途径

非光合微生物可以通过不同的固定CO2途径进行生长[图1(b)]，主要包括WL 途径、RTCA 途径、DC−4HB 循环和3HP−4HB 循环[22]。WL 途径只能在严格的厌氧条件下运行，关键酶为一氧化碳脱氢酶、甲酸脱氢酶和甲酰基呋喃脱氢酶[16]，每固定2mol CO2需消耗1mol ATP 与4mol NAD(P)H，产物为乙酰辅酶A[14]。DC−4HB 循环可以在厌氧和微氧条件下运行，关键酶为4−羟基丁酰辅酶A脱水酶，每固定1mol CO2与1mol HCO−3需消耗3mol ATP 与4mol NAD(P)H，产物为乙酰辅酶A[17]。3HP−4HB循环是好氧循环，关键酶为4−羟基丁酰辅酶A 脱水酶，每固定2mol HCO−3需消耗4mol ATP 与4mol NAD(P)H，产物为乙酰辅酶A[18]。为了提供CO2固定循环所需的ATP 和还原力，非光合微生物已经进化出各种能量供给模块，如可以从光、氢、硫等获取能量，但是由于CO2中的碳原子处于最高的正价态，在热力学上极为不利，仍有极大的改造空间[23]。

1.2 强化CO2固定途径

自养微生物可利用CO2作为唯一碳源，将无机碳转化为有机代谢物，直接合成各种高值化学品，包括生物柴油、生物活性物质、生物肥料等[24]。但由于自养微生物生长速度较慢、转化效率较低、改造工具不够完备等缺点，极大地限制了其在工业上的应用。目前，通过提高CO2固定途径效率、开发能量捕集系统、调节碳代谢流分布等策略（图2），可以有效改善CO2的生物资源化利用效率[25]。

图2 自养微生物CO2固定的强化策略

1.2.1 提高CO2固定效率

代谢改造自养微生物强化CO2封存是一种环境友好的方案，同时还可以生产高值化学品，提高经济效益[19]。近年来，研究人员通过提高羧化酶催化效率、改造与优化CO2固定途径等策略[图2(a)]，提高了自养微生物的CO2固定效率。在CBB 循环中，虽然羧化酶发挥了至关重要的作用，但是RuBisCo也是限制蓝藻CO2固定效率的瓶颈之一，主要原因在于RuBisCo 催化的1,5−二磷酸核酮糖（RuBP）氧化反应与羧化反应竞争能量与碳流。基于此，通过引入一种蛋白质融合标签（FLAGtag），提高了RuBisCo 的表达水平与活性，改善了Synechocystissp. PCC 6803 的光合作用与菌株生物量[26]，且在Synechocystissp. PCC 6803 中 过 量 表 达RuBisCo 后，乙醇产量提高了55%[8]。然而，部分天然的RuBisCo 每秒只能固定3 个CO2分子，羧化效率仍有很大的提高空间[27]。因此，研究人员通过蛋白质工程改造RuBisCo 获得突变体SP5−V330T，改善了羧化酶的结构以及酶活性，使沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）的比生长速率提高了80%[28]。通过对伴侣蛋白GroEL/ES 和RbcX 进行表达调控后，使用RuBisCo 依赖型E. coli对蓝藻Ⅰ型RuBisCo 进行了定向进化，从而将羧化效率提高了约3 倍，且该突变体的应用能使SynechocystisPCC 6803的光合作用速率提高了约55%[29]。另外，近年来通过新酶资源挖掘，RuBisCo 效率也得到了进一步提升。例如，通过在细胞质中表达来自巨型管虫（Riftia pachyptila）的Ⅱ型RuBisCo（RPE RuBisCo），有效改善了Synechocystissp. PCC 6803的RuBisCo氧合酶活性，乙醇酸产量达到了2.8g/L[30]。在改造与优化CO2固定途径方面，通过引入异丙醇合成途径消耗胞内NADH以干扰ATP和NADH需求，从而驱动光反应和暗反应的耦合，使SynechocystisPCC 6803的CO2固定率提高了38%[31]。丙二酰辅酶A−草酰乙酸−乙醛酸（MOG）途径也是一种更具潜力的CBB循环替代方案，CO2催化周转率为CBB循环的2～3 倍[32]。此外，对已知的CO2固定路径进行重组，能够进一步合成具有高转化效率与动力学优势的CO2固定途径，包括还原甘氨酸途径、C4−乙醛酸循环等[33−34]。将上述CO2固定路径引入到自养微生物中，有望进一步提高自养微生物的CO2固定效率。

1.2.2 开发能量捕集系统

自养微生物CO2固定需要大量能量，藻类可以通过光能诱导叶绿体类囊体膜上的电子传递链产生NADH，为CBB 循环提供还原力[35]。发展能量捕集系统的重要方法之一是优化光能和电能的利用[图2(b)]。对于能够自主捕集光能的微生物，可以通过调节质子泵视紫红质（PR）改善藻类对太阳光谱的利用率[36]，例如：通过在Synechocystissp. PCC 6803中异源表达质子泵，证明了优化PR的表达可以将太阳能转化为可利用的代谢能量，使工程菌株具备了一定的生长优势[37]。另外，由于过度吸收光辐射会造成光损伤和光抑制，表达截短的捕光天线复合体（TLA）也能够提高藻类的光合作用效率。例如：将TLA 技术应用于Synechocystis后，有效地限制了细胞过度吸收光子的能力，最终使光合生产效率提高了约57%[38]。对于不能自主捕集光能的微生物，可以使用纳米材料搭建人工光系统，如纳米沸石材料[39]、双频纳米线[40]、基于钴酞菁的纳米管[41]等。例如：利用热醋穆尔菌（Moorella thermoacetica）与镉离子（Cd2+）共培养形成沉淀CdS 后，光照下CdS产生电子供给WL途径并促进CO2转化为乙酸，其光能转化为乙酸的峰值量子产率为2.44%[42]。未来可利用基因工程优化自养微生物的光合系统，运用蛋白质工程开发新的捕光蛋白，并应用新型材料增加微生物细胞与材料的亲和性，改善电子的传输效率。

1.2.3 调节碳代谢流分布

大多数蓝藻过量合成的化合物是由中间代谢物转化而来，其中使用最广泛的中间代谢物是丙酮酸，远离中心碳代谢的胞内代谢物浓度会明显低于胞内丙酮酸浓度[43]。因此，通过强化合成途径和增加碳源供给[图2(c)]，可以改善碳代谢流通量，从而提升目标代谢物的产量[44]。增强产物合成途径可以从中间代谢物中提取碳流，用于提高碳固定池的储量，诱导微生物细胞上调碳捕集机制，从而增加碳固定初始前体的积累量[44]。例如，在Synechocystissp. PCC 6803 中，通过强化表达甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径，增加了类异戊二烯的代谢流通量，最终使类胡萝卜素产量提高了1.5倍[45]。另一方面，转录因子可以对代谢网络进行更全面的碳代谢流通量调控。例如，转录因子PSR1 是触发细胞溶质脂质积累的关键开关，能够介导微藻脂质的高效积累[46]。此外，补充碳源可以提供额外的碳结构单元和能量，促进自养微生物的生长与生物量转化，进而提高固碳能力与代谢物产量。例如，在葡萄糖与光混合营养条件下，工程菌株细长聚球藻（Synechococcus elongatesPCC 7942）固定CO2生产2,3−丁二醇的产量提高了2倍，而且在添加90mmol/L乙酸盐的条件下可以进一步合成22mg/L 异丙醇[47]。随着基因组工程和代谢工程的快速发展，通过精细化调节自养微生物固碳途径的碳代谢流通量，从而提高自养微生物目标代谢物合成效率，为实现工业化应用奠定基础。

2 异养微生物固定CO2

异养微生物可以通过代谢途径中的羧化反应来固定CO2，所需底物和能量都源自有机物的分解[48]。在异养微生物生产化学品的过程中，理论上需要足够的能量才能驱动CO2固定途径的正常运行，实现CO2固定的净收益。因此，加强异养微生物的CO2固定策略，主要包括强化CO2羧化途径、重构CO2固定途径、优化CO2固定过程中的能量供给等（图3）。

图3 异养微生物CO2固定的强化策略

2.1 强化CO2羧化途径

异养微生物具有各种天然的羧化反应，最典型的为PEP 羧化反应[49]和巴豆酰羧化反应[50]。羧化反应的通量是决定异养微生物固碳能力的重要因素，但是已知的羧化酶在固定途径中的催化效率仍然存在不足。因此可以通过强化羧化反应效率、构建人工羧酶体等策略[图3(a)]，提升异养微生物的羧化效率。

2.1.1 强化羧化反应效率

为促进异养微生物封存CO2合成高价值化学品，通常可以通过增强羧化反应效率、优化底物或产物转运速率等策略强化异养微生物的羧化途径。以E. coli生产苹果酸为例，通过过量表达来自M. succiniciproducens的PEP 羧激酶，成功提高了PEP羧化反应效率，同时改善了苹果酸前体（草酰乙酸）的合成效率，最终使苹果酸的生产强度达到了0.77g/(L·h)[9]。此外，转运蛋白也可以协助提升羧化反应的效率。例如，通过在米曲霉（Aspergillus oryzaeNRRL 3488）中过量表达丙酮酸羧化酶与C4−二羧酸转运蛋白C4T318，使苹果酸的生产强度提升至0.94g/(L·h)[51]。通过在E. coli中过量表达CO2转运蛋白（sbtA或bicA）和异源PEP羧化酶，工程菌株的琥珀酸产量增加了10%[49]。除此之外，针对不同的羧化反应需求与羧化酶特性，借助合成生物学方法将蛋白质工程、开关工程等策略用于进一步改进羧化效率。

2.1.2 构建人工羧酶体

羧酶体由紧密堆积的分子层构成，具有六聚体单元，仅允许较小的代谢物通过[52]，并且已经成功在异养微生物E. coli中构建出具有六面体结构的人工羧酶体[53]。通过将来源于硫氧化菌（Halothiobacillus neapolitanus）羧酶体的编码基因HnCB 引入E. coliDH5α，获得了功能性的六面体结构，且具有更高的CO2固定效率[53]。另外，通过在E. coli中共表达辅助模块（来自E. coli的伴侣蛋白GroEL/S 和来自蓝藻的RbcX）和遗传模块（来自海洋原绿球藻（Prochlorococcus marinusMED4）羧酶体的7 个结构蛋白和结构稳定因子csoS1D），成功合成了源于P. marinusMED4的人工羧酶体，为实现E. coli高效同化CO2提供了一个模块化的平台[54]。然而，由于人工羧酶体的构建过程非常复杂，并且多种外源基因的引入会对宿主菌株的代谢和生长会造成不可避免的抑制作用，因此，在异养微生物中借助人工羧酶体固定CO2生产化学品距离实际的工业化应用还有一定的差距。

2.2 重构CO2固定途径

与异养微生物的天然羧化反应相比，重构CO2固定途径能够更好地调节碳通量，实现目标产物的合成。但是，构建高效的CO2固定途径需要对多种异源酶进行合理的整合与优化，这仍然是一个重大挑战。目前，对于异养微生物CO2固定途径重构的研究，主要集中于天然固碳途径的异源引入与优化、混菌固碳路径的创建等方面[图3(b)]。

2.2.1 引入异源CO2固定途径

通过将CO2固定途径引入异养微生物，从而可以在异养微生物体内构建获得完整的CO2固定模块，包括3−HP 循环和CBB 循环等。由于3−HP 循环中的CO2固定率较高，受氧气限制较小，研究人员将3−HP 循环细分为4 个子路径，即丙酰辅酶A合成、琥珀酸合成、乙醛酸生成和乙酰辅酶A 再生、丙酮酸生成和乙酰辅酶A 再生，并在E. coliK12 中以操纵子的形式表达了3−HP 循环中的关键酶mcra和pcs[55]。虽然部分3−HP 循环已经成功在E. coli中构建，但是3−HP 循环仍然不能完整地运行[55]。因此，研究人员进一步尝试了CBB循环和还原甘氨酸途径。例如，通过在E. coli中表达源自蓝藻CBB循环的关键酶——磷酸核糖激酶（PRK）和RuBisCo，并结合蓝藻中参与碳富集的碳酸酐酶，有效地改善了E. coli的CO2固定效率，最终工程菌株的CO2固定速率提升至22.5mg CO2/g DCW/h[56]。为进一步强化异源CO2固定途径的功能，通过计算机模型设计与实验室定向进化相结合，将完整的CBB循环分为两个模块（TCA循环模块和CBB循环模块），最终在异源宿主E. coli中构建了功能齐全的CO2固定循环，能够在无外源输入有机碳的情况下合成己糖和戊糖，获得了首个半自养型E. coli[57]。然而，在宿主菌株中完全引入异源且催化步骤较多的CO2固定路径会造成较大的菌株代谢负荷，且部分路径关键酶会对菌株生长产生不利影响。因此，如何在保障宿主菌株细胞生长与产物合成的基础上充分合理地分配胞内资源改善宿主菌株的CO2固定效率仍然是一个巨大的挑战。

2.2.2 构建混菌CO2固定体系

混菌发酵体系可以有效地结合不同微生物各自的优点，往往具有更高的鲁棒性和生产效率。将混菌发酵体系应用于CO2固定过程，可实现不同菌株的劳动分工，先利用固碳微生物将CO2转化成更易代谢的底物或者中间代谢物，再利用非固碳微生物将中间代谢物应用于目标产物的合成[58]。通过将混菌体系中的不同菌株安排在不同功能模块中，有利于充分发挥菌株各自的最佳生理功能，最终建立新的多步固碳路径[59]。2016年，研究人员提出了一种两阶段系统的集成转换方法，可以将气态一碳原料转化为生物脂质，最终用于生产生物柴油。在第一阶段，在厌氧生物反应器中使用M. thermoacetica将气体混合物（CO2、CO、H2）转化为乙酸；在第二阶段，利用解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）以乙酸为底物生产C16～C18三酰基甘油酯，总生产强度达到了0.19g/(L·h)[60]。不久后，研究人员进一步采用细菌共培养体系，以CO2为原料生产聚羟基链烷酸酯（PHA）。首先利用S. elongatus cscB将CO2转化为蔗糖，再借助恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida cscAB）以蔗糖为底物生产PHA，生产强度可达23.8mg/(L·d)[61]。未来可以通过以下几个方面进一步提高混菌发酵体系的适用性，主要包括开发更廉价的生物反应器、研究更适宜的生长条件、确立更合理的碳源分配策略和探索更高效的模块化生产等。

2.3 优化CO2固定能量供给

在异养微生物固定CO2生产化学品的过程中，对能量有着较高的要求。不仅如此，CO2固定长路径的驱动也需要较多的能量供应。稳定持续的能量供给对于维持代谢流通量和微生物生产性能都具有重要作用，如在工业高密度发酵过程中，微生物的细胞生长和产物合成通常受到还原力供应的限制[62]。基于此，一方面可以优化内源能量的供给直接为细胞提供更多的能量，另一方面也可以利用外源易获取的能量来弥补能量缺口[图3(c)]。

2.3.1 内源能量的供给

在异养微生物中，天然能量代谢在所有生物过程中具有最高的质量通量密度，为后续的代谢与转化提供了全部的能量驱动力[63]。目前，优化异养微生物CO2固定过程中能量供给策略，主要侧重于直接增加NAD(P)H 与ATP 供应、改善底物磷酸化水平、改造电子传输链等。优化细胞内源能量代谢的最直接的方式是增加NAD(P)H与ATP 供应。例如，通过在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中功能性表达CBB循环关键酶——PRK和RuBisCo，促使S. cerevisiae工程菌株以CO2作为NADH 再氧化的电子受体，从而使乙醇产量提高了14%[64]。同样的方法同样也适用于E. coli。在E. coli中引入CBB 循环关键酶的基础上，将ATP 再生型磷酸烯醇丙酮酸羧激酶与ATP 消耗型RuBisCo 相结合，有效改善了工程菌株的CO2固定效率，最终使苹果酸产量提高至387mmol/L[65]。此外，异养微生物内源还原力的调控还可以通过改善底物磷酸化水平和改造电子传输链来实现[62]。例如，借助产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）以CO2和H2为底物直接生产乙醇时，利用双功能醛/醇脱氢酶（AdhE）将乙酰辅酶A转化为乙醛再生成乙醇。但是，当AdhE失活后，C. autoethanogenum先通过底物水平磷酸化，将乙酰辅酶A转化为乙酸并产生ATP，再利用铁氧还蛋白氧化还原酶（AOR）将乙酸还原为乙醛，最后通过NAD(P)H 依赖型乙醇脱氢酶（Adh）生成乙醇，实现了高效利用ATP 间接生产乙醇，最终乙醇产量增加了180%[66]。另外，通过在E. coliT110 中表达电子传递蛋白MtrCAB 复合物、富马酸还原酶（FccA）和碳酸氢盐转运体（BT），并结合电化学系统，实现了电子从MtrCAB到FccA的传递，成功强化了CO2固定过程并将琥珀酸产率提高了近2 倍[67]。总体而言，在构建高效能量供给途径实现“开源”的同时，减少微生物CO2固定途径中的能量消耗进行“节流”，是解决微生物能量瓶颈的有效策略。

2.3.2 外源能量的利用

与自养微生物相比，异养微生物更容易从有机碳源中获得能量。光能、电能与氢能的有效利用有利于进一步降低外源能量的成本。在光能利用方面，研究人员通过集成CO2固定模块和CO2减排模块，开发了异养微生物CO2模块化封存策略[68]。首先，设计了一条新型的CO2固定途径HWLS，并借助细胞外膜锚定型光敏感纳米电子捕获通道，促进NAD+还原产生NADH，用于补充HWLS 途径所需的NADH。其次，设计了基于蓝细菌转录因子NdhR 的CO2动态减排开关，并借助细胞内膜光敏感质子嗅探通道，产生跨膜质子动力势，促进ADP高效转化为ATP，用于补充CO2减排所造成的ATP 供应不足。最后，通过整合CO2固定模块和CO2减排模块，显著提高了E. coli的CO2封存效率，使苹果酸和丁酸的得率提高至1.48mol/mol 和0.79mol/mol。在电能利用方面，光合电子传递链循环电子流可以提供更多的ATP。研究人员将光敏剂苝二酰亚胺衍生物（PDI）和聚（芴−共亚苯基）（PFP）涂覆在M. thermoacetica膜表面并形成p−n异质结后，借助静电相互作用，阳离子侧链通过疏水相互作用插入细胞膜，保证电子有效地传递给目标菌株，避免氧化还原穿梭跨膜运输时的额外能量消耗。因此，M. thermoacetica可从异质结中获取光生电子，从而驱动WL 途径固定CO2合成乙酸，将量子产率提高至1.6%[69]。在氢能利用方面，研究人员借助产乙酸菌（Clostridium ljungdahlii）证明了H2在丙酮生产中的实用性。由于丙酮生产过程中的脱羧步骤会造成CO2净排放，因此补充H2可以提供C. ljungdahlii固定CO2所需的还原力，增强CO2的再吸收能力，最终丙酮的产量可以达到异养发酵理论最大值的138%[70]。未来可深入开发基于光能、电能的高效电子供给系统，在降低成本的前提下解决CO2固定过程中还原力和能量供给不足的问题。

3 人工微生物固定CO2

近年来，研究人员致力于在异源宿主内运行完整的CO2固定途径以构建人工的CO2固定微生物。然而，在提高CO2固定效率方面仍然存在很多挑战，如：需要补充额外的能量源以满足固碳能量需求、关键固碳酶的稳定性与催化效率有待进一步提高、固碳途径在异源宿主中的CO2同化效率较低等[71]。因此，需要开发人工微生物固定CO2的策略，主要的研究进展包括两个方面：设计与构建人工CO2固定途径（表2）、开发与合成人工CO2固定微生物。

表2 人工CO2固定途径

3.1 人工CO2固定途径

在对天然CO2固定途径挖掘和解析的基础上，近年来研究人员借助计算机辅助设计，提出了许多人工CO2固定途径（图4）。虽然人工设计的CO2固定途径在理论上具有更好的热力学可行性与更高的能量利用效率，但其仍然难以满足工业生物制造的要求。目前，运用体外多酶体系构建路径效率高、能量需求小的人工固碳途径，并通过捕集外源能量以驱动固碳途径。

图4 人工CO2固定途径

3.1.1 固碳路径的设计与优化

新兴的合成生物学可以自由组合不同生物来源的酶促反应，为创建人工CO2固定途径提供了新思路，大多数人工的CO2固定途径在动力学或热力学上均优于自然进化的CO2固定途径[33]。近年来，较为成熟的人工CO2固定途径主要包括：CETCH 循环[50]、rGly 途径[75]、POAP 循环[72]、乙酰辅酶A 双循环（acetyl−CoA bicycle）[73]和还原乙醛酸−丙酮酸合成（rGPS）循环与苹果酰辅酶A−甘油酸（MCG）途径组成的rGPS−MCG 系统[74]。CETCH 循环是由17 种酶组成的好氧循环，关键酶为巴豆酰辅酶A羧化酶（Ccr），每将1mol CO2转化为乙酰辅酶A需消耗1mol ATP 和4mol NAD(P)H[1]，CO2转化率为5nmol CO2/(mg 蛋白·min)[50]。rGly 途径是好氧途径，关键酶为2−酮戊二酸合酶和 ATP−柠檬酸裂解酶，每将1mol CO2转化为乙酰辅酶A 需消耗2mol ATP和4mol NAD(P)H[1]。POAP 循 环 是 由Pyc、Oah、Acs、Pfor 催化的厌氧循环，每将2mol CO2转化为1mol草酸盐需消耗2mol ATP和1mol NAD(P)H，CO2固定率为8.0nmol CO2/(mg CO2固定酶·min)[72]。乙酰辅酶A双循环分为碳固定、糖异生和非氧化糖酵解三个功能模块，每固定2mol CO2需消耗2mol 乙酰辅酶A并生产3mol乙酰辅酶A，关键酶为丙酮酸合酶（rPFOR）[73]。rGPS−MCG 系统对O2不敏感，关键酶为Ccr，每将2mol HCO3–转化为1mol乙酰辅酶A需消耗5mol ATP和5mol NAD(P)H，CO2固定率为28.5nmol CO2/(mg 核心蛋白·min)[74]。虽然体外人工固碳路径的设计突破了酶活性与生长量的限制，能够独立控制反应速率与减少能量消耗，但是人工路径设计不仅要考虑途径的能量成本，还要考虑维持途径通量所需的酶蛋白成本[71]。

3.1.2 能量供给模块的引入

一般来说，微生物可以通过消耗来自H2、自然光、电力或化学物质等外源能量的方式进行捕集与利用CO2[76]。目前，能量供给模块的构建方式，主要包括运用电极−微生物杂化体、补充电能载体以及构建生物类囊体等。在电极−微生物杂化体的应用方面，将卵形孢子菌（Sporomusa ovata）与氟化碳纳米乳剂结合后，该材料可作为H2的载体以提高H2的传递效果，从而可以强化H2驱动的CO2还原途径，使乙酸的合成效率提高了1.9 倍[77]。另外，借助石墨氮化碳（g−C3N4）和H2O2降解酶建立了一种杂交光合系统，g−C3N4捕获光能并将其转化为电子，还原H+生成H2，H2O2降解酶分解H2O2生成O2。基于NAD(P)+转氢酶和氧化磷酸化（OXPHOS）产生的H2和O2，有效改善了真养罗尔斯顿菌（Ralstonia. eutropha）的NAD(P)H和ATP供应，使得菌株利用CO2合成聚羟基丁酸的产量增加了1倍[78]。在电能载体补充方面，为了实现电力驱动CO2固定，借助甲酸作为电化学的能量载体，使得R. eutrophaH16能够利用电能还原CO2生产高级醇，最终产量达到了1.4g/L[79]。在生物类囊体构建方面，基于光合作用原理的启发，通过仿生系统将类囊体膜和CETCH 途径酶结合以构建人工类囊体，在光驱动下可以将CO2转化为多碳化合物（如乙醇酸）[80]。目前，人工光能、电能利用系统的转化效率还有待进一步提高，未来可以通过引入新型材料，改善材料的稳定性、生物相容性，提高固碳微生物的电子收集效率与能量利用效率，从而构建更高效的CO2固定驱动系统。

3.2 人工CO2固定微生物

合成生物学的一个重大挑战是如何在将异养微生物转化为自养微生物，也就是如何在异养微生物运行完整的CO2固定途径使异养微生物以CO2为唯一碳源进行细胞生长与产物合成。目前，已经分别构建完成了以CO2为唯一碳源、甲酸为唯一能源的化能自养型E. coli和以CO2为唯一碳源、甲醇为唯一能源的P. pastoris。

3.2.1 自养型大肠杆菌

E. coli具有遗传背景清晰、遗传操作工具完备、生长速度快等优点，是一个良好的模式生物系统，可以作为利用CO2合成生物质的宿主菌株。2016 年，研究人员通过模块分割CBB 循环，构建完成了首个半自养型E. coli，该菌株同化的碳来源于CO2与丙酮酸[57]。2020年，研究人员将自养系统构建与适应性进化相结合，在引入CBB 循环与甲酸能量供给系统的基础上，将工程菌株进行适应性进化350 天后，获得了以CO2为唯一碳源、甲酸为唯一能源的化能自养型E. coli[81]。这项研究是人工CO2固定微生物方面的重大突破，也证明了实验室定向进化能够将细胞适应性与所需功能相结合，帮助异养微生物整合CO2固定途径[81]。

3.2.2 自养型毕赤酵母

甲基营养型P. pastoris可以利用甲醇作为唯一的能源和碳源进行生长，是生产酶和化学品的合适底盘，被广泛应用于工业酶和药物的生物制造[82]。2020 年，研究人员通过结合过氧化物酶体改造与多种异源酶表达，将P. pastoris原有的甲醇同化途径改造为类似CBB循环的CO2固定途径，并结合长期的适应性进化，获得了以CO2为唯一碳源、甲醇为唯一能源的化能自养型P. pastoris，且细胞比生长速率达到了0.018/h[10]。这项研究再次证明了异养微生物向合成自养微生物转化可能性，具有跨时代的科学意义，但是合成的自养型微生物的生长和生产速率相对较为缓慢，因此距离工业化应用还有很大差距。

4 结语

针对微生物实现CO2封存的研究，国内外研究人员采用合成生物学、代谢工程、材料科学、电化学等策略，对自养微生物、异养微生物和人工微生物的CO2固定途径进行了重构与优化。然而，目前微生物CO2固定的相关研究尚处于初步发展阶段，仍然存在很多不足，例如：固碳反应的能量供给与转换效率仍需提高、高效的CO2固定有待进一步开发、CO2固定微生物的碳利用效率常常达不到工业化要求等。因此，未来的研究重点可以围绕CO2固定关键酶、途径和微生物三个方面进行。

（1）在CO2固定关键酶方面，系统挖掘天然固碳酶和理性设计人工固碳酶。一方面，从极端微生物中筛选更加适合于微生物CO2固定的高性能固碳酶；另一方面，借助AlphaFold 进行结构预测并理性设计人工固碳酶，提高CO2固定效率。

（2）在CO2固定途径方面，挖掘与优化天然固碳途径、逆向设计人工固碳途径和开发能量捕获与再生系统。深入挖掘天然微生物的固碳机理，根据机理进一步优化已知天然固碳途径；借助ATLASx、RetroPath 等工具预测固定CO2合成目标化合物的代谢途径及其催化酶，通过对比筛选生物逆合成途径，获得新的人工固碳途径；利用高效捕获光能的新型材料与高特异性的生物催化系统，开发能量捕获与再生系统，实现光驱生物催化与高价值化学品合成。

（3）在CO2固定微生物方面，仿生构建人工固碳组件，如人工羧酶体、人工叶绿体、人工叶片、无膜细胞器等，并与微生物进行耦合，最终使微生物真正具备固定CO2的“功能性器官”。