启宫丸对多囊卵巢综合征大鼠WNT/β-catenin信号通路的影响

李晓俊 杨斌 谢京红

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是在遗传、环境等多种复杂因素共同影响下引起的一种育龄期妇女常见内分泌及代谢紊乱疾病，主要临床特征包括：月经紊乱或闭经、高雄激素血症、多囊样卵巢、胰岛素抵抗等。越来越多的证据表明卵巢颗粒细胞(granulosa cell，GC)凋亡水平增加是PCOS的发生关键病理机制；其中Wnt信号通路是调节细胞增殖、凋亡的经典通路，在卵巢卵泡发育中至关重要[1-2]。目前促进PCOS卵巢GC增殖并抑制其凋亡是PCOS主要治疗策略[3]。中医学认为PCOS的发生与肾、脾、肝三脏功能失调，痰浊、瘀血阻滞密切相关。众多医家认为痰湿阻滞胞宫是PCOS发生的主要原因[4-5]。启宫丸具有健脾化湿，行气祛痰、启宫助孕的作用，在临床治疗PCOS中疗效显著。本实验通过观察启宫丸对PCOS大鼠性激素水平的表达、卵巢病理组织形态、凋亡状况及Wnt/β-catenin信号通路的蛋白表达的影响，探究启宫丸对PCOS模型大鼠的治疗作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD雌性大鼠，40只，5～6周龄，体质量为180～220 g，购自北京市华阜康生物科技股份有限公司。动物生产许证号：SCXK(京)2017-0001，室温(22±2)℃，相对湿度 55%～65%。

1.2 药品与试剂

来曲唑片，规格：2.5 mg/片，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：22003153。

启宫丸，药物组成：半夏20 g、香附20 g、川芎20 g、白术20 g、神曲15 g、茯苓15 g、苍术12 g、橘红12 g、甘草6 g，药物均由中国中医科学院西苑医院中药房提供及质检，统一采用中药煎药机煎制，制成浓缩药液(含生药量0.735 g/mL)。

炔雌醇环丙孕酮片，商品名：达英-35，德国拜耳医药保健有限公司，批号：KT09FJ52。

羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，美国Sigma公司，批号：1002375619。

1.3 主要仪器

3K18型离心机(美国Sigma)，Olympus BX53型显微镜，TP1020型全自动脱水机(德国Leica)，RM2235型组织切片机(德国Leica)，Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics)。

1.4 实验方法

1.4.1 造模 所有实验大鼠均进行2天的适应性喂养，采用随机数法在40只雌鼠中选取10只为正常组，正常组采用普通饲料喂养，余下30只大鼠灌注服来曲唑联合高脂饲料喂养进行造模。造模组每日灌胃给药来曲唑溶液1 mg/(kg·d)溶于0.5%(质量分数)。同时给与高脂饲料喂养(配方：普通饲料60%、蛋黄粉12%、猪油11%、全脂奶粉5%、蔗糖5%、花生5%、麻油1.5%、食盐0.5%)，连续21天，进行造模处理，正常组灌服等体积溶剂。造模第7天起，每天进行阴道涂片，观察2个周期，以阴道上皮细胞持续角化者为造模成功[6-7]。

1.4.2 分组与给药方法 模型建立成功后，将30只成模大鼠随机分为模型组，中药启宫丸组、阳性药达英-35组，每组10只。中药启宫丸组和达英-35组统一按照女性60 kg体质量，采用人和大鼠体表面积换算法计算用药剂量，中药组给予14.7g/(kg·d)，口服灌胃，每日一次。达英-35组给0.21 mg/(kg·d)口服灌胃，每日一次，正常组及模型组给予等量蒸馏水灌胃，干预周期为3周。实验结束后无动物死亡情况。各组大鼠末次给药结束后，当晚8：00后禁食，于次日测量各组大鼠体质量并记录，以10%水合氯醛麻醉，抽取腹主动脉血约5 mL，静置20分钟后3000 r/min离心15分钟，吸取上层血清置于离心管中。取血后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，统一取出子宫及卵巢。以4%的甲醛中固定。便于后续HE染色及免疫组化检测。

1.5 检测指标

1.5.1 ELISA法检测血清激素水平 按照ELISA试剂盒说明书，测定各组大鼠血清睾酮(testosterone，T)、雌二醇(Estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)、促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormonel，FSH)的激素水平并计算LH/FSH比值。

1.5.2 HE染色观察卵巢组织病理变化 卵巢组织10%中性福尔马林切开固定24小时后，取材，梯度酒精脱水，将透明组织浸入60℃石蜡中包埋，制成石蜡块。将石蜡块进行4 μm连续切片，烤片，二甲苯脱蜡后下水，HE染色，脱水、封片后置于显微镜下观察大鼠卵巢组织病理变化。

1.5.3 TUNEL染色观察卵巢组织凋亡状况 石蜡切片3 μm，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，20 μg/mL蛋白酶K工作液溶解蛋白酶。PBS冲洗，滴入TUNEL混合液50 μL，加盖玻片，置于37℃暗黑盒中反应1小时，PBS冲洗，DAB显色，发生凋亡的细胞核显示淡黄色至深棕色。高倍镜下拍摄3个连续不重复视野，统计每个视野中细胞总数和阳性凋亡细胞总数，计算凋亡率即TUNEL阳性率(%)=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.5.4 采用免疫组化法检测Wnt、β-catenin蛋白在大鼠卵巢组织中的表达 石蜡切片3 μm，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，采用柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10分钟。PBS液冲洗，滴加一抗Wnt、β-catenin(浓度分别为1/100，1/200)，4℃孵育过夜，次日常温下复温0.5小时，滴加二抗孵育30分钟，DAB显色，镜下观察显色程度，显色后自来水冲洗终止反应，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。高倍镜下拍摄3个连续不重复视野，采用Image-pro Plus6.0图像分析软件测定阳性信号的积分光密度(integral optical density，IOD)值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠血清中E2、T、P表达的比较

与正常组比较，模型组血清T水平升高，E2及P水平明显减低(P<0.01)；与模型组相比较，启宫丸组及达英-35组中E2及P水平升高，T水平下降，差异有统计学意义(P<0.01)。如表1所示。

表1 各组大鼠血清T、E2及P表达水平比较

2.2 大鼠血清中FSH、LH及LH/FSH数值比较

与正常组比较，模型组LH及LH/FSH水平显著升高、FSH水平下降，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，启宫丸组和达英-35组LH水平及LH/FSH比值均显著降低(P<0.01)，FSH水平均有不同程度升高，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。如表2所示。

表2 各组大鼠血清FSH、LH及LH/FSH表达比较

2.3 大鼠卵巢组织病理改变

镜下可见：正常组表现为大鼠卵巢组织中随处可见处于不同发育阶段的各级卵泡。其中优势卵泡中可见形态完整的多层GC(多为6～8层)，可见正常黄体。模型组表现为卵泡总体数量减少，闭锁卵泡、囊状卵泡增多，多数卵泡呈囊性改变，GC层数减少变薄(多为3～4层)，排列紊乱，黄体减少。启宫丸组表现为卵泡总体数量无明显减少，可见各级生长卵泡，闭锁卵泡相对较少，少量卵泡呈囊性改变，GC层数明显增加(多为4～6层)，排列规则，可见少量黄体、白体，GC数增多。达英-35组卵泡发育及闭锁卵泡改善方面效果同启宫丸组，但是GC层稀疏较少(多为3～4层)。如图1所示。

注：A正常组; B模型组；C启宫丸组; D达英-35组

2.4 大鼠卵巢组织凋亡状况

TUNEL阳性表达在卵巢组织GC核内，呈淡黄色至深棕色染色。正常组大鼠卵巢组织仅有少量TUNEL阳性细胞散在分布。与正常组相比，模型组TUNEL阳性细胞率明显升高(P<0.01)；与模型组相比，启宫丸组和达英-35组TUNEL阳性细胞率明显下降(P<0.01)，其中启功丸组和达英35组TUNEL阳性细胞率未见明显差异(P>0.05)。如表3所示。

表3 各组大鼠卵巢组织凋亡状况比较

2.5 大鼠卵巢组织Wnt、β-catenin蛋白表达

检查指标Wnt和β-catenin表达在卵巢组织的GC胞膜及胞浆内，呈淡黄色至棕黄色，以胞膜为主，卵泡膜细胞偶有表达，本次实验仅统计GC胞膜表达部分，正常组Wnt及β-catenin蛋白呈强阳性表达，表达范围广泛。与正常组相比，模型组Wnt及β-catenin蛋白表达水平均显著下降(P<0.01)，表达率减少；与模型组相比，启宫丸组和达英-35组Wnt及β-catenin表达水平均有不同程度上升(P<0.05或P<0.01)，表达范围增加。如图2～3、表4所示。

表4 各组大鼠卵巢组织Wnt、β-catenin蛋白表达比较

注：A正常组;B模型组；C启宫丸组;D达英-35组

注：A正常组;B模型组；C启宫丸组;D达英-35组

3 讨论

PCOS是女性常见异质性生殖、代谢紊乱疾病，是导致育龄期女性不孕的主要原因，占无排卵性不孕的75%[8]。远期可引起肿瘤、心脑血管疾病、血脂血糖异常等多种内分泌代谢系统并发症[9-10]，严重危害患者身心健康及家庭，现代流行病学调查显示：该病在育龄期女性的发病率为6%～21%[11]，是目前生殖医学领域主要研究方向。临床主要治疗方式包括调整月经周期、促排卵、手术等，但副作用多，治疗效果不理想。本病属于中医学中闭经、月经过少、不孕、癥瘕、崩漏等范畴，历代医家认为PCOS的主要病机为水湿内停，积聚成痰，阻滞胞宫。因此，根据“治病求本”的原则，临床治疗应以燥湿化痰为法。启宫丸出自清代医家汪昂《医方集解》，组方以二陈为君药加行气活血药而成，能治妇人体肥痰盛，脂膜闭塞子宫，不能孕育。临床大量研究证明启宫丸能够降低PCOS患者体质量、调节HPO轴激素分泌、促进优势卵泡形成及排卵，改善PCOS患者的临床症状[12-13]，但其治疗机制尚待不明确。

PCOS的关键病理改变是卵泡发育障碍，表现为卵泡发育程中激素分泌异常，卵泡募集亢进、闭锁，GC凋亡异常增加，无优势卵泡形成及排卵等。本实验研究显示，模型组大鼠卵巢组织中可见明显多囊样扩张卵泡，闭锁卵泡增加，无成熟卵母细胞，黄体数目减少，GC排列紊乱，稀疏变薄退化。启宫丸组大鼠卵巢组织镜下可见各级卵泡形态正常，GC层数较模型组增多，可见少量黄体及白体，提示可能存在排卵。卵泡的发育受到激素的调控，与卵巢GC关系密切[14]。GC内包含FSH、E、T相关激素受体，对FSH和LH刺激作出反应，能增加P450arom(P450芳香酶)基因的转录，促进雄激素向雌激素转化，刺激卵泡的生长和排卵[15]。同时GC还具备合成E2和P等类固醇的能力，增强LH排卵峰正反馈作用，从而诱导排卵。与模型组相比，经启宫丸治疗的大鼠FSH显著升高，LH、LH/FSH明显降低。T水平升高、E2、P水平降低。提示启宫丸干预后能够提升PCOS大鼠卵泡质量，增加GC层数，纠正激素失衡状态。表明启宫丸对PCOS具有较好的治疗作用。

近些年，研究发现GC的异常增殖凋亡可能是PCOS发病的病理基础[16-18]。卵泡经历募集、选择，形成优势卵泡后，其余卵泡发生闭锁，卵泡的闭锁取决于卵巢GC的凋亡机制。GC增殖和凋亡信号通路之间的平衡决定卵泡的命运。本实验通过TUNEL法对比各组大鼠卵巢组织凋亡状况，结果证明模型组大鼠卵巢组织凋亡率明显增加，而经过启宫丸治疗后PCOS大鼠凋亡率明显降低。提示启宫丸能抑制大鼠卵巢GC凋亡水平。Wnt/β-catenin信号通路在GC中表达，参与卵泡发育、排卵、增殖与凋亡过程，与 GC功能异常及PCOS 的发生密切相关。

Wnt/β-catenin通路通过调节下游分子核内原癌基因c-Myc及细胞周期蛋白cyclinD1的表达，来调控细胞的增殖、凋亡、分化及迁移功能[19]。β-catenin是Wnt通路中的核心分子，非活化状态下定位于细胞胞浆，正常情况下胞浆内糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)复合体通过磷酸化、泛素化对β-catenin进行降解，使得其浓度水平较低，无法介导下游信号。当细胞被特定因素刺激时，Wnt与位于细胞膜表面的Frizzled受体结合，诱导GSK-3β复合体解离，解除了对β-catenin的抑制作用，激活下游靶基因。Wnt/β-catenin通路对卵巢发育的影响，一方面体现在Wnt/β-catenin与性激素受体通路存在多种方式的交互作用，是卵巢类固醇激素分泌重要的调控途径；另一方面体现在决定细胞命运走向，调控细胞的存活、增殖、分化和凋亡活动，与GC的增殖、排卵、黄体化和卵泡闭锁等重要的卵巢发育事件紧密相连[20]。既往研究表明Wnt通路可以促进卵泡GC雌激素的分泌，同时能够调节FSH及LH激素分泌，对类固醇生成和及排卵有积极作用[21]。Wu等[22]发现PCOS患者β-catenin及其下游靶蛋白(Survivin、BMP4)的表达与凋亡因子Bax和Bcl-2的表达成反比，认为WNT/β-catenin通路参与调控卵巢细胞凋亡，是PCOS形成的重要机制。专家学者逐渐认识到Wnt/β-catenin或可成为PCOS新的治疗靶点，但尚未有相关研究进行验证。本实验发现，模型组卵巢GC较正常组Wnt、β-catenin表达水平显著降低，中药启宫丸组较模型组改善明显。表明启宫丸能提高wnt/β-catenin信号通路的表达，减少GC凋亡。

综上所述，本研究表明启宫丸可改善PCOS症状，促进卵泡发育可排卵，其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路，减少GC凋亡反应，调节卵巢激素分泌，从而促进卵泡发育与排卵有关。本实验样本量较小，未来需要进行大量实验及临床研究进一步验证。