贮藏年限对不同居群白羊草种胚线粒体抗氧化性能的影响

朱梦馨， 曾 佳， 夏方山， 赵奥然， 李晓波， 王 勃， 李尹琳

(山西农业大学草业学院， 山西 太谷 030801)

种业是国家战略性、基础性核心产业[1-2]，是发展草牧业的坚实支撑[3]，而优良乡土草种质资源的收集、评价及创新利用是实现我国民族草种业高质量发展的重要基础。白羊草(Bothriochloaischaemum)作为山西省及其周边省区暖性灌草丛类草地的重要乡土草种，具有高产耐牧、适口性好、饲用价值高等优点[4]，近年来已被作为重要的优良牧草和生态草资源在山西及周边省区广泛种植，因而白羊草种子的需求量日益增加，使其良种繁育及贮藏越来越受到人们的关注。然而，种子生理成熟时，其种子活力也达到了顶峰，然后其内部便出现一系列不可逆的劣变，生理生化特性也发生变化，种子质量出现下降，致使其种用价值不断降低[5]。因此，探究不同白羊草种质资源的耐贮藏性，进而选育出耐贮藏的白羊草新品种，是解决白羊草种质资源及其良种贮藏的重要途径。

贮藏过程中种子活力的丧失是由活性氧(Reactive oxygen species，ROS)自由基的积累而引起的种子老化造成的[6]。线粒体是细胞的能量供应中心[7]，在种子老化过程中发挥着重要的作用。线粒体老化学说[6]将老化、ROS和线粒体联系起来，认为细胞老化过程离不开线粒体的参与。线粒体电子传递链上的复合物Ⅰ和复合物Ⅲ是ROS等自由基的主要产生位点[8]，这已在大豆(Glycinemax)[9]和燕麦(Avenasativa)[10]等种子的老化研究中证实。此外，ROS自由基的大量积累会攻击细胞膜、蛋白质等，导致细胞内生物大分子的氧化受损，刺激线粒体结构功能的改变，从而引起细胞内部代谢等功能的紊乱[11-12]。研究老化过程中的玉米(Zeamays)[13]种子发现，线粒体外膜修复能力逐渐降低，线粒体的细胞色素c氧化酶活性及线粒体细胞色素c氧化酶途径的呼吸速率逐渐降低，表明种子老化破坏了线粒体膜的完整性及呼吸功能。研究人工老化的大豆[14]种子发现，随着老化时间的延长，ROS含量逐渐增加，当ROS产生与清除失衡时便会引发氧化胁迫，使得种子胚轴线粒体膜结构严重解体，基质变稀，抗氧化酶活性逐渐降低，最终导致线粒体抗氧化系统崩溃，氧化损伤加剧。这与贮藏年限对老芒麦(Elymussibiricus)[15]种胚线粒体抗氧化功能的影响规律相似。

目前，种子老化与线粒体关系的研究已成为热点问题，在多种牧草及作物种子上均已开展一定研究。然而，同种植物不同居群的染色体核型进化程度及遗传多样性存在着差异[16-17]，却尚未有贮藏年限对不同植物居群种胚线粒体抗氧化性能影响的相关报道。本试验通过分析不同贮藏年限的不同居群白羊草种胚线粒体抗氧化酶活性及脂质过氧化程度的变化，探讨不同居群白羊草种子的耐贮藏特性，以期为评价不同白羊草种质资源的耐贮藏性提供理论基础，对白羊草种质资源的安全保存与创新利用具有十分重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为2017，2018，2019及2020年收获于山西农业大学草业学院校内实验基地的山西省代县、平鲁、平定、柳林及太谷5个居群的白羊草种子，种子采集于每年10月进行，收获后在含水量10%(鲜重基础)条件下于-4℃冷库中密封保存至2021年10月进行试验，种子贮藏年限分别为1，2，3，4年。

1.2 生理指标的测定

种胚线粒体的提取参照Yin[18]的方法，略作改动，称取不同贮藏年限及居群白羊草种子0.1 g，加入20 mL预冷的线粒体提取缓冲液，冰浴研磨5 min，4层纱布过滤后，反复离心洗涤获得线粒体悬浮液。上述所有步骤均在0℃～4℃的条件下进行。每个处理设4次重复。

可溶性蛋白含量按照南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性的测定参照Rao和Sresty[19]的方法，1 mL反应体系中加入10 μL线粒体进行测定；抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)活性的测定参照Nakano和Asada[20]的方法，1 mL反应体系中加入10 μL线粒体进行测定；过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性的测定参照Aebi[21]的方法，3.4 mL磷酸缓冲液加入10 μL线粒体和200 μL 0.1 mol·L-1H2O2；谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase，GR)活性的测定参照Madamanchi等[22]的方法，1.7 mL反应体系中加入10 μL线粒体进行测定；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量测定参照Bailly等[23]的方法，加入10 μL线粒体进行测定。

1.3 数据统计分析

试验数据在Excel 2019软件中进行整理，用SPSS 26.0软件对整理的数据进行方差分析，Duncans法进行多重比较(P<0.05)，结果用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 贮藏年限对不同居群白羊草种胚线粒体SOD活性的影响

随着贮藏年限的延长，各居群白羊草种胚线粒体SOD活性呈现逐渐降低的趋势(表1)，不同居群间存在差异。相较于贮藏第1年，代县、平鲁、平定及柳林居群的白羊草种胚线粒体SOD活性在贮藏第2年均出现显著降低(P<0.05)；贮藏第4年时，太谷居群的白羊草种胚线粒体SOD活性出现显著降低(P<0.05)，且显著低于其他贮藏年限(P<0.05)。贮藏1～4年，太谷及平定居群白羊草种胚线粒体SOD活性均处在相对较高水平。

表1 贮藏年限对不同居群白羊草种胚线粒体SOD活性的影响Table 1 Effects of storage years on SOD activities of embryonic mitochondria in different populations of Bothriochloa ischaemum 单位：U·mg-1 protein

2.2 贮藏年限对不同居群白羊草种胚线粒体CAT活性的影响

随着贮藏年限的延长，各居群白羊草种胚线粒体CAT活性呈现逐渐降低的趋势(表2)，不同居群间存在差异。相较于贮藏第1年，代县、平鲁、平定及柳林居群的白羊草种胚线粒体CAT活性在贮藏第2年均出现显著降低(P<0.05)；贮藏第4年时，太谷居群的白羊草种胚线粒体CAT活性出现显著降低(P<0.05)，且显著低于其他贮藏年限(P<0.05)。贮藏1～4年，太谷及平定居群白羊草种胚线粒体CAT活性均处在相对较高水平。

表2 贮藏年限对不同居群白羊草种胚线粒体CAT活性的影响Table 2 Effects of storage years on CAT activities of embryonic mitochondria in different populations of Bothriochloa ischaemum 单位：U·min-1·mg-1 protein

2.3 贮藏年限对不同居群白羊草种胚线粒体APX活性的影响

随着贮藏年限的延长，各居群白羊草种胚线粒体APX活性呈现逐渐降低的趋势(表3)，不同居群间存在差异。相较于贮藏第1年，代县、平鲁、平定及柳林居群的白羊草种胚线粒体APX活性在贮藏第2年均出现显著降低(P<0.05)；贮藏第4年时，太谷居群的白羊草种胚线粒体APX活性出现显著降低(P<0.05)，且显著低于其他贮藏年限(P<0.05)。贮藏1～4年，太谷及平定居群白羊草种胚线粒体APX活性均处在相对较高水平。

表3 贮藏年限对不同居群白羊草种胚线粒体APX活性的影响Table 3 Effects of storage years on APX activities of embryonic mitochondria in different populations of Bothriochloa ischaemum 单位：μmol·min-1·mg-1 protein

2.4 贮藏年限对不同居群白羊草种胚线粒体GR活性的影响

随着贮藏年限的延长，各居群白羊草种胚线粒体GR活性呈现逐渐降低的趋势(表4)，不同居群间存在差异。相较于贮藏第1年，代县、平鲁、平定及柳林居群的白羊草种胚线粒体GR活性在贮藏第2年均出现显著降低(P<0.05)；贮藏第4年时，太谷居群的白羊草种胚线粒体GR活性出现显著降低(P<0.05)，且显著低于其他贮藏年限(P<0.05)。贮藏1～4年，太谷及平定居群白羊草种胚线粒体GR活性均处在相对较高水平。

表4 贮藏年限对不同居群白羊草种胚线粒体GR活性的影响Table 4 Effects of storage years on GR activities of embryonic mitochondria in different populations of Bothriochloa ischaemum 单位：U·min-1·mg-1 protein

2.5 贮藏年限对不同居群白羊草种胚线粒体MDA含量的影响

随着贮藏年限的延长，各居群白羊草种胚线粒体MDA含量呈现逐渐升高趋势(表5)，不同居群间存在差异。相较于贮藏第1年，代县、平鲁、平定及柳林居群的白羊草种胚线粒体MDA含量在贮藏第2年均出现显著升高(P<0.05)；贮藏第4年时，太谷居群的白羊草种胚线粒体MDA含量出现显著升高(P<0.05)，且显著高于其他贮藏年限(P<0.05)。贮藏1～4年，太谷及平定居群白羊草种胚线粒体MDA含量均处在相对较低水平。

表5 贮藏年限对不同居群白羊草种胚线粒体MDA含量的影响Table 5 Effects of storage years on MDA contents of embryonic mitochondria in different populations of Bothriochloa ischaemum 单位：μmol·mg-1 protein

3 讨论

种子的内部基因决定种子的潜在寿命，而种子活力的保持取决于外部环境因子的综合影响[24-25]，其中贮藏时间是影响种子活力的重要因素，随着贮藏时间延长，种子老化程度加深，种子活力下降。在种子老化过程中，ROS不断积累，诱导细胞发生膜质过氧化作用逐渐增强，膜结构受损[11]，而MDA作为植物体内脂质过氧化的标志性产物，其含量的高低可以反映膜结构受损情况，从而衡量种子老化受损的程度[26]。同时，植物细胞中SOD，APX，CAT和GR等组成的抗氧化系统协同进行作用，清除细胞内积累的ROS，保护生物膜系统。在本试验中，各居群白羊草种胚线粒体SOD，CAT，APX及GR活性随贮藏时间的延长逐渐降低，白羊草种胚线粒体MDA含量随贮藏时间的延长逐渐升高，这可能是由于随着贮藏时间的延长，种子老化程度加深，种子内部ROS不断积累，加剧了膜质过氧化作用，种胚线粒体MDA含量升高，这与前人在凤丹(Paeoniaostii)[27]、大豆[28]等作物中的研究试验结论相似。当细胞膜结构受到MDA胁迫时，白羊草种胚线粒体抗氧化酶活性被激活，增强了细胞质的抗氧化能力[29]，能够及时有效的清除ROS自由基，降低膜质过氧化程度，保护细胞免受其损害；但随着种子老化程度加深，ROS富集到一定程度，便会打破植物体内ROS产生系统与消除系统间的动态平衡，导致过量的ROS无法被清除[30-31]。

不同居群白羊草种子的耐贮藏性也不同，其抗氧化酶活性变化也就不尽相同。代县、平鲁及柳林居群白羊草种胚线粒体SOD，CAT，APX及GR活性在贮藏第2年显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)，这可能是由于积累的ROS会攻击DNA、蛋白质等大分子，线粒体中抗氧化酶系统遭到破坏，抗氧化酶活性下降，消除线粒体中ROS的能力降低；同时，生物膜结构受损，种胚线粒体MDA含量逐渐升高，进而对细胞结构造成不可逆的氧化损伤，甚至导致细胞凋亡[32-33]。平定居群白羊草种胚线粒体MDA含量虽在贮藏第2年显著升高(P<0.05)，但其表现出较高的种胚线粒体SOD，CAT，APX及GR活性，能够及时清除多余的ROS，可以缓解线粒体膜结构受损情况。贮藏1～3年，太谷居群白羊草种胚线粒体SOD，CAT，APX及GR活性处在较高水平，表现出较强的清除ROS的能力，这与其较低水平线粒体MDA含量相一致，说明线粒体膜结构受损程度较轻时，MDA含量较低，抗氧化酶清除ROS效率高，能够更好地抵御种子老化损伤；而贮藏第4年，太谷居群白羊草种胚线粒体SOD，CAT，APX及GR活性显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)，说明此时线粒体中抗氧化系统遭到严重破坏，积累的ROS未得到及时清除，膜质过氧化作用逐渐增强，线粒体膜结构严重受损，这可能是由不同居群长期所处的生态环境存在差异造成了其遗传多样性发生了变化[17]。

4 结论

白羊草种子线粒体抗氧化能力与贮藏时间关系密切。随着贮藏时间的延长，不同居群白羊草种胚线粒体抗氧化能力均呈下降的趋势，其耐贮藏特性表现也存在差异。太谷居群白羊草种子的耐贮藏时间可为3年，代县、平鲁、平定及柳林居群白羊草种子的耐贮藏时间以1年为佳。