潜伏相关核抗原在卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染过程中的作用

路正东,晏巍振 综述 王林定,周 畅 审校

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus,KSHV),又称为人类疱疹病毒8型,是一种双链DNA病毒,常导致感染者出现内皮细胞肿瘤,即卡波氏肉瘤(Kaposis sarcoma,KS )。临床上常表现为皮肤多发性斑点状或斑块状等内皮细胞侵袭性表现[1]。KSHV在宿主体内常处于潜伏和裂解两种状态,潜伏相关核抗原(latency-associated nuclear antigen,LANA)是维持其潜伏期的关键蛋白,也是潜伏期含量最高的蛋白。潜伏期间的KSHV可在LANA的介导下,将基因组连接到宿主染色体上,从而使病毒基因组和宿主细胞同步复制[2]。目前,临床上常在裂解期进行治疗,主要原因是KSHV在潜伏期对抗病毒药物具有很强的耐药性和逃避宿主免疫杀伤的能力,而裂解期的治疗效果则相对欠佳,故LANA可作为未来的研究重点。该文就LANA蛋白的作用机制和研究进展进行综述。

1 概述

1.1 KSHVKSHV是一种致癌病毒,可导致KS等多种恶性肿瘤。KSHV基因组包含一个大约140 kb长的中央独特编码区和两侧高GC含量的非编码末端重复序列(terminal repeat units,TR)[3],主要负责病毒蛋白表达。潜伏感染期间,病毒基因组在宿主细胞核中转换为一个环状集合体,使病毒的转录翻译能力高度受限,无法仅靠自身完成病毒的复制,必须通过和宿主细胞的基因结合才能产生下一代病毒。该机制使得病毒在宿主体内维持一个非常低的水平,难以激活宿主的免疫反应,保证了病毒基因组的长久存在。

1.2 KSKS是一种高度血管化及增生性的内皮细胞源性肿瘤,来源于淋巴内皮细胞,以炎症和广泛的新血管生成为特征,具有特殊的双阶段生命周期[4]。感染早期,常常出现充分延长的梭形细胞大量增殖的特征性表现,随着感染的加剧,梭形细胞数量增加,最终在晚期占主导地位,在血管缝周围形成交织束,产生肉眼可见的结节。临床表现为免疫逃避、炎症和血管生成的混合症状。

1.3 LANA基因和蛋白LANA是一种含有1 162个氨基酸,220～230 kDa大小的多功能蛋白质,分为N端、C端和中央天冬氨酸/谷氨酸的重复序列[5]。C端结构域直接与KSHV基因组的保守TR序列结合。富含赖氨酸的N端中的染色质结合结构域(chromatin-binding domain, CBD)与宿主染色体对接,从而使KSHV基因组和宿主染色体形成一个整体结构。当宿主细胞进行有丝分裂时,连接在宿主染色体上的KSHV基因组同步进行复制,使得KSHV基因组持续存在于宿主细胞中,这是LANA最具特征性的功能之一。除了介导自身复制外,LANA蛋白还可以与多种肿瘤抑制蛋白相结合,降低这些蛋白的抑癌作用[6]。此外,LANA也被认为与促进血管的生成及宿主免疫系统逃逸有关,能够保证KSHV的持久存在。因此,在KSHV的潜伏期间,LANA作为一种高度表达且作用广泛的致癌蛋白,在KSHV感染的发病机制中起着核心作用。

2 LANA的作用机制

2.1 介导自身复制KSHV潜伏期的特征是在高度有序的核遗传物质结构中保证自身的存在,同时保持有限的病毒基因复制,不产生感染性子代。过去的研究[7]证明,LANA以宿主细胞中的组蛋白H2A和H2B (H2A/B)为连接点,将病毒片段连接到细胞染色体上,与宿主细胞DNA同时复制并分离病毒基因片段到新生成的宿主子细胞核中。除了连接作用,LANA蛋白还具有调节作用,促进病毒基因组的连接和复制,保证病毒的长期存活和基因的稳定复制。

2.1.1募集核小体组装蛋白1 (nucleosome assembly protein 1,NAP1) NAP1L1是核小体组装蛋白1的成员之一,由391个氨基酸蛋白组成,在转录和DNA复制中发挥了组蛋白结合和核小体组装等多种作用。病毒基因在S期复制时,NAP1L1会与LANA蛋白中靠近CBD的氨基末端结合,结合有NAP1L1的LANA蛋白会募集于KSHV的TR区域并与其结合,从而发挥NAP1L1的复制与组装作用[8]。在KSHV基因复制过程中,除了负责复制和组装外,NAP1L1也可以使病毒基因染色质化,降低其活性,负调控病毒裂解基因的转录,减少级联反应的发生,确保KSHV持续处于潜伏期状态。在LANA蛋白的募集作用下,NAP1L1还可以抑制部分基因启动子的转录,如RTA和K1基因,研究[9]表明NAP1L1与LANA一起表达时,RTA启动子和K1启动子的活性都有所下降,但详细机制尚不明确,可能是由NAP1L1破坏协同激活子p300与其它组蛋白的复合物结构所导致。这些研究证明了LANA募集的NAP1L1在调节部分启动子转录活性及自我复制的重要性。

2.1.2寡聚体结构的稳定结合性 相关成像显示,在潜伏感染期间,LANA蛋白中与KSHV基因TR序列结合的部位,即LANA DNA结合域(DNA binding domain,DBD),会形成包括十聚体、五聚体和螺旋体等多种高阶寡聚体结构[10]。在KSHV的复制过程中,LANA寡聚体结构与TR区紧密结合,随后招募细胞复制起始因子到该区,如起源识别复合体,该因子对病毒DNA复制和片段维持具有重要作用。同时,寡聚体结构可以自动调节ORF73基因的转录,在KSHV基因组的TR序列和ORF73序列之间存在一个使用染色质构象捕获(chromatin conformation capture,3C)的DNA环,该环结构可以有效维持病毒的潜伏期,而寡聚体结构可以促进该DNA环的形成。若LANA DBD未形成寡聚体结构,LANA与TR结合的稳定性下降,病毒基因组易发生重排,DNA组易丢失,无法在宿主体细胞中完成正常复制。此外,3C DNA环也可能丢失,从而使病毒脱离潜伏期进入活跃期,无法建立持久的潜伏感染。LANA DBD寡聚结构的复杂性也会影响KSHV的复制能力,简单的寡聚体结构可以有效驱动病毒DNA的有效连接和类宿主染色质化,从而达到感染期间的持续潜伏状态。低寡聚体结构也可以促进核小体复合体的合成,通过克服LANA蛋白与核小体结合的能障[11],提供LANA蛋白结合于宿主DNA及合成核小体复合体的驱动力。

2.2 促血管产生促血管产生是KS肿瘤的一个重要标志,KS肿瘤的早期阶段也存在高度血管化,即组织学变化表现为血管裂隙增生、红细胞外渗和大量水肿。一般而言,血管产生是一种可暂时缓解病情的代偿性表现,但在部分情况下,血管增生反而会进一步加重病情。KSHV感染过程中可诱导多种血管生成细胞因子,包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)、血管生成素-2等,以两种不同的分泌方式诱导血管生成[12]。异常血管的产生有利于KSHV的转移,进而加重病情,同时也会为肿瘤细胞提供营养物质,促进肿瘤细胞的增生和转移。

2.2.1上调表皮生长因子样结构域7(epidermal growth factor-like domain 7,EGFL7) EGFL7是一种促血管生成细胞因子,也被称为血管内皮抑制素,属于VEGF家族。EGFL7在内皮性病变部位高度上调,常导致宿主出现病理性的血管生成和内皮细胞增殖。研究[13]表明,与正常人相比,KS肿瘤病人的EGFL7水平升高,且LANA的表达是导致该因子上调的主要原因。LANA对EGFL7表达的调控表现为隔离死亡域相关蛋白(death-associated protein,Daxx),降低Daxx与EGFL7的结合,从而减少Daxx对于EGFL7的抑制作用。Daxx是一种多功能蛋白,可与多种宿主细胞蛋白结合,参与调节转录和凋亡等多种细胞活动。Daxx通过与禽红母细胞病病毒E26癌基因同源物1 (avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1,Ets-1)结合从而抑制Ets-1活性,Ets-1是正调控EGFL7表达所需的核心转录因子。而LANA Glu/ Asp结构域与Daxx结合后,具有对Daxx的隔离能力以及消除其对Ets-1的抑制作用的能力。Co-IP和免疫印迹实验[14]表明,LANA与Daxx的结合破坏了Daxx与Ets-1之间的联系,使EGFL7表达上调,促进血管的生成和内皮细胞的生长;除此之外,该实验也证明当LANA蛋白过表达时,不仅隔离了过表达的内源性Daxx,还隔离外源性Daxx,这加大了相关临床治疗的难度。除了促血管生成作用,EGFL7还参与肿瘤的生长和转移。临床研究[15]表明,KSHV感染的原发性渗出性淋巴瘤细胞(BC3和BCBL1)的EGFL7蛋白上调,提示EGFL7可能在KSHV诱导的恶性肿瘤中起重要作用。

2.2.2上调缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1) HIF-1血管生成因子由组成型表达的β亚基和氧调节的α亚基组成,α亚基在正常氧张力下不稳定,但在低氧张力环境或一些激活的异常生长因子作用下稳定。KSHV感染后,LANA会使α亚基在宿主体内异常稳定表达,α亚基的两个同源物HIF-1α和HIF-2α表达明显上调,增加HIF-1的转录活性。在LANA的影响下,HIF因子与邻近内皮细胞上的受体结合,上调VEGF等蛋白表达,促进新血管的生成及KS肿瘤的生长。LANA除了直接调节HIF-1外,也能调控丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase M2,PKM2)来间接调节HIF。PKM2作为HIF-1的辅助激活因子被转运到细胞核中,促进HIF-1α的合成,其含量的增加保证了HIF-1对于新血管生成的高效调控。相关研究[16]表明,抑制KSHV细胞中PKM2会导致HIF-1所调控的基因表达减少;使用PKM2 siRNA抑制PKM2可以阻断HIF -1依赖的VEGF启动子的激活、表达和分泌。

2.3 延长KSHV生存时间

2.3.1酸性结构域读取器抑制p53的作用 近期研究[17]表明,LANA包含两个串联的、部分重叠的酸性结构域序列,位于第332～465氨基酸,与SET易位蛋白(SE translocation,SET)癌蛋白酸性结构域序列同源。该结构域可以模拟SET结合的过程,优先与非乙酰化p53的羧基末端相互作用形成免疫共沉淀,抑制p53活性。同时,LANA还可能结合其它蛋白质来对病毒的持久性产生影响。例如,cAMP反应元件结合蛋白(CBP)可以和p53结合,使p53出现乙酰化,显著降低LANA与p53的相互作用;LANA可以与CBP相互作用并抑制其乙酰化酶的活性,从而保证自身对于p53的抑制作用,防止宿主细胞被p53蛋白破坏,避免自身凋亡,延长了感染细胞与KSHV自身的生存时间。虽然LANA片段中的第845～895氨基酸中也存在较低的同源酸性序列,但病毒的持久潜伏状态仍主要依赖于LANA第332～465片段中的酸性结构域读取器[18]。如果缺少相关的酸性结构域读取器,那病毒将无法保持持久的潜伏感染状态。此外,LANA的富酸性结构域可以直接与Daxx相互作用,促进血管的生成,也可以为自身的长期存在提供有利的条件。

2.3.2LANA操纵G1-S进程 在细胞周期中,E2F基因的表达是细胞周期进入S期所必需的,对于维持正常的细胞稳态及复制具有重大意义。正常情况下,Cdk4/6-cyclin D和Cdk2-cyclin E在表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)等多种细胞因子作用下激活,激活的复合物会磷酸化视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)家族蛋白,抑制其对于E2F转录因子的失活影响[19]。在感染细胞中,LANA与RB相互作用并增强对于E2F转录因子的失活作用,使细胞周期无法正常进入S期。LANA还可以与糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)相互作用,GSK-3β参与磷酸化和周期调节因子的降解,导致G1-S进程延长。在细胞周期中,毛细血管扩张性共济失调(ataxia telangiectasia mutated,ATM)/毛细血管扩张性共济失调相关(ataxia telangiectasia and related,ATR)蛋白和细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase1,Chk1)/细胞周期检测点激酶2(checkpoint kinase2,Chk2)可以调节细胞的自身凋亡,通过磷酸化p53蛋白来阻滞G1-S的进程。研究[20]表明,LANA可以直接与Chk2相互作用,阻断ATM/ ATR介导的自身凋亡,延长G1-S进程。除了作用于Chk2,LANA蛋白也与ATM/ATR结合,降低其对murine double minute2 (Mdm2)因子的失活作用。此外,LANA也可以直接结合并阻断p53介导的转录活性,进而抑制p53诱导的细胞凋亡,延长宿主细胞周期。LANA还可以正向调节细胞周期依赖启动子,并通过维持周期蛋白依赖激酶抑制剂p16的过表达来诱导G1-S细胞周期的延长。在高LANA含量的细胞中,Chk1/Chk2蛋白明显上调,p53蛋白活性降低,KSHV感染细胞存活率明显上升。

2.3.3逃避宿主免疫监测 KSHV可以抑制多种免疫系统途经,躲避宿主免疫监测是重要的辅助发病模式之一,LANA可以促使CD8+T细胞产生干扰蛋白酶体来抑制主要组织相容性复合体Ⅰ类(major histocompatibility complex,MHC-I)的表达,也可以通过抑制CD4+T细胞来阻断Ⅱ类反式激活蛋白(class Ⅱ transactivator,CIITA)转录和其与调节因子X(regulatory factor X,RFX)复合物相互作用,从而下调主要组织相容性复合体Ⅱ类(major histocompatibility complex,MHC-Ⅱ)基因的反应[3]。LANA通过与KSHV的mRNA形成g-四链复合物则是上述免疫逃逸反应的主要影响因素。LANA在与自身mRNA结合形成四链复合物后,可以有效减少mRNA翻译来抑制氨基酸抗原的合成,降低抗原的呈递,以此来逃脱宿主的免疫系统。相关研究[21]显示,当KSHV阳性细胞中g-四联体结构稳定时,LANA的抗原提呈被下调。LANA还可以抑制会对g-四重体的合成起负向调节作用的异质核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNPs),以此来发挥免疫逃逸作用。hnRNPs是一种RNA结合蛋白家族,主要调节基因表达,包括mRNA剪接、维持mRNA的稳定转运以及蛋白质翻译的调节。hnRNPs可与g-四联体选择性结合,潜在破坏g-四重复合物,而LANA则可以显著抑制上述的破坏作用[22]。潜伏期KSHV感染的宿主细胞中,LANA水平和hnRNP A1与LANA mRNA的相对结合量常呈反比关系。当LANA在细胞核中的浓度足够高时,相对结合量则较低,以此确保hnRNP A1不会破坏g-四重体,抑制mRNA输出到细胞质,使其无法翻译,降低可用于抗原提呈的蛋白质水平。由于g-四环复合物在病毒生命周期中发挥了关键性作用,作为KSHV的药物治疗靶点具有重要意义。

3 展望

LANA具有介导自身复制、上调EGFL7促血管生成、逃避宿主免疫系统等多种功能。基于LANA能够阻断Daxx与Ets-1的相互作用、上调EGFL7和促进血管生成这一机制,采用人为调控EGFL7进行靶向治疗或联合治疗,减少血管的生成,阻断KSHV相关恶性肿瘤的发展。除此之外,LANA蛋白能够直接结合并阻断Chk1/Chk2蛋白的诱导凋亡、减少p53蛋白的磷酸化及抑制p53,从而逃避宿主免疫系统。以该机制为研究方向,可有效促进抗原的提呈,使KSHV及时被宿主免疫系统识别,阻滞KSHV的复制,提高机体的免疫能力。对LANA蛋白主导下的多种机制进行深入研究,可以为开发新型抗病毒药物和早期抗感染药物提供重要依据。