扩展青霉菌实时定量PCR内参基因挖掘与应用

张真真, 蒋礼玲, 李婉炘, 王谨凡, 贾举庆, 黄胜雄

(1.合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601; 2.青海大学农林科学院,青海 西宁 810016; 3.山西农业大学 农学院,山西 晋中 030801)

0 引 言

内参基因可以定义为在特定条件下预期表达水平不受影响的基因,其在不同的实验处理条件下或不同组织、器官中可稳定地表达[1-2]。实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是最常用的检测基因表达水平和验证RNA-seq结果数据的技术方法[3]。结合目标基因与内参基因的实时定量PCR数据进行适当的标准化,可以得到精确且可以相互比较的目标基因的表达值。标准化依赖于所选择的内参基因,不稳定表达的内参基因将显著影响目标基因表达定量的准确性和可靠性。

18S核糖体rRNA(18SrRNA)、肌动蛋白基因(ACT)、延伸因子基因(EF-1α)、微管蛋白基因(TUB)、聚泛素基因(UBQ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)等[4-6]管家基因(HKGs)参与基本的细胞过程,被认为具有稳定的表达水平,经常被广泛作为内参基因使用。越来越多的研究表明,部分管家基因在不同生长、发育阶段或不同处理条件下的组织材料中的表达水平存在较大的波动[7-9]。

因此,对于特定的实验材料,开发和鉴定特异的内参基因很有必要。目前在生物学研究中,基于geNorm[10]、NormFinder[11]、BestKeeper[6]在内的生物软件对实时定量PCR数据的统计分析,已经成功筛选得到适用于不同特异的实验材料所需的内参基因。微生物研究中,内参基因的研究多集中于对传统内参基因稳定性的评估,新的内参基因的开发研究较少[12-13]。有研究者认为可以根据基因的功能类别,发现新的内参基因,选择适合特定微生物物种的特定内参基因[14]。文献[15]基于基因功能注释,利用实时定量PCR,通过geNorm、NormFinder、RefFinder 软件评价,筛选出适用于柑橘黄龙病菌感染不同寄主及感染不同时期的新内参基因ftsZ和gyrA。文献[16]基于转录组测序,采用geNorm和NormFinder软件筛选及定量验证发现了优于传统内参基因的glyS和degV基因更适合作为嗜热链球菌的新内参基因。

扩展青霉菌(Penicilliumexpansum)属于青霉菌属[17],侵染苹果、猕猴桃、柑橘等水果果实,造成大规模的经济损失。目前,扩展青霉菌的研究主要集中在基因组学、毒力基因的挖掘、棒曲霉素代谢等方面。40SribosomalproteinS24(PEX2-023930)基因常常被作为实时定量PCR的内参基因,但其在扩展青霉菌不同生长阶段存在稳定的基因表达水平尚未得到验证。目前,扩展青霉菌缺乏系统的筛选和评估内参基因的研究，随着扩展青霉菌中分子生物学研究的深入开展,开发和验证新的内参基因具有重要的意义和应用价值。

1 材料与方法

1.1 微生物材料

扩展青霉菌由以色列农业部农业研究组Samir Droby教授提供,由本课题组保存。

1.2 基于RNA-seq的候选内参基因挖掘和注释

用灭菌枪头刮取PDA平板上培养7 d的扩展青霉菌的孢子,悬浮于含0.02% Tween-20的蒸馏水中,调制为108个/mL孢子液。取该孢子液2 mL加入到30 mL PDB液体培养基中,分别置于4、25 ℃条件下180 r/min振荡培养,在生长8、12 h时分别离心收集菌体,液氮中冷冻1 h以上,将菌体样品送派森诺公司进行转录组测序。

基于RNA-seq的基因表达值,候选内参基因的筛选标准如下:转录组数据中基因表达值的平均值≥15 FPKM,且变异系数≤0.15。满足以上条件的基因被筛选鉴定为候选内参基因。利用Blast2GO软件进行候选内参基因在基因本体(gene ontology,GO)数据库中的注释。

1.3 候选内参基因实时定量PCR引物设计

从RNA-seq数据鉴定的候选内参基因中随机挑选14个基因(Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase)进行后续研究。利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)引物设计软件Primer-Blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)进行实时定量PCR实验的引物设计。所有设计的引物退火温度为58～62 ℃。实时定量PCR扩增的条带大小限制在80～200 bp之间。

1.4 总RNA提取和cDNA反转录合成

在4、25 ℃条件下180 r/min,PDB液体培养基中生长6、12、24、36 h的扩展青霉菌,离心弃上清,-80 ℃超低温冰柜保存备用。

利用RNA提取试剂TransZol UP(TransGen,China)进行扩展青霉菌总RNA的提取。cDNA反转录合成的20 μL反应体系的主要成分如下:2 μg的总RNA,2 μL的5×gDNA Buffer,2 μL的10×King RT Buffer,1 μL的FastKing RT Enzyme Mix(TIANGEN,China),2 μL 的FQ-RT Primer Mix,RNase-free ddH2O补足到20 μL。反应条件如下:42 ℃,15 min;95 ℃,3 min。

1.5 实时定量PCR扩增体系与反应条件

利用LightCycler 96 PCR System(Roche, Swiss)进行基因的实时定量PCR。20 μL的反应体系如下:0.5 μL的cDNA,10 μL的2×SuperReal Color PreMix(TIANGEN,China),0.5 μL的Dilution Buffer,引物各0.6 μL,7.8 μL的ddH2O。

反应条件如下:95 ℃,15 min;95 ℃,10 s,60 ℃,30 s,重复40个循环;然后从60 ℃升温到95 ℃进行熔解曲线分析。每个样品重复3次实时定量PCR实验。

1.6 候选内参基因的稳定性分析

本文利用LightCycler 96 PCR System自带软件导出实时定量PCR的结果数据(Cq值)。将Cq值作为输入数据,分别在geNorm[11]、NormFinder[12]软件中进行候选内参基因的表达稳定性分析。

2 结果与分析

2.1 候选内参基因的挖掘和注释分析

RNA-seq数据包括4、25 ℃条件下,分别在PDB液体培养基生长8、12 h的扩展青霉菌孢子的基因表达值。首先,设置基因在4个样品中的基因表达值的平均值≥15 FPKM,过滤掉低表达不可信的基因;其次,设置4个样品之间基因表达值的变异系数≤0.15,筛选稳定表达的基因,过滤掉不同样品之间基因表达水平差异大的基因;最后,满足以上条件的共有694个基因被鉴定为候选内参基因,约占全基因组编码基因的6%(694/11 060)。

利用Blast2GO软件,在GO数据库进行了694个候选内参基因的GO注释,提取了“Molecular Function”模块中的功能注释。“Molecular Function”模块中基因富集最多的9个GO条目见表1所列。从表1可以看出，最多有15个基因富集在2级GO条目“Binding”;在3级GO“Heterocyclic compound binding”和“Organic cyclic compound binding”条目中,均存在于9个基因定位中。从富集结果看,这些稳定表达的基因主要涉及催化和绑定结合两大功能。

表1 “Molecular Function”模块中的9个富集GO条目

2.2 候选内参基因的挑选和片段克隆

从694个候选内参基因中随机挑选14个基因,包括Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase,进行后续的实时定量PCR实验。14个基因在RNA-seq数据中的表达值见表2所列。在4个RNA-seq样品之间,Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase基因的表达水平均值为(28.49±0.35)～(1 711.72±197.61)FPKM;表达水平的变异系数介于0.01～0.12。最稳定表达的基因是Hp1(PEX2-018900),变异系数为0.01。

表2 RNA-seq数据中14个候选内参基因的表达水平

基于基因序列进行了上述14个基因的实时定量PCR引物设计,引物退火温度为58～62 ℃,扩增长度为80～200 bp,具体引物序列见表3所列。首先进行了基因片段的常规PCR扩增实验,扩增结果如图1所示，图1中,L1～L14泳道分别表示Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase基因的扩增结果。

表3 候选内参基因的定量PCR引物

由图1可知,本文得到了特异的DNA扩增条带,大小和设计完全一致。表明设计引物适用于目的基因特异片段的扩增,可以用于后续的实时定量PCR实验。

图1 候选内参基因的常规PCR扩增结果

2.3 候选内参基因的稳定性分析

以在PDB液体培养基中4、25 ℃条件下生长6、12、24、36 h后的扩展青霉菌为实验材料,对Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase基因进行实时定量PCR实验。

14个候选基因的熔解曲线均只存在一个重叠峰,没有杂峰产生，其中Isy1的熔解曲线峰图如图2所示。结果证明实时定量PCR扩增条带单一,实验成功进行。

图2 Isy1基因的熔解曲线

将Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase基因在25 ℃条件下不同生长阶段的扩展青霉菌材料的实时定量PCR结果Cq值作为输入数据,在geNorm和NormFinder软件中分别进行稳定性分析,结果如图3所示,由图3可知,数值越低稳定性越高,geNorm分析结果默认高于1.5阈值的基因不适合作为内参基因。

图3 14个候选内参基因在NormFinder和geNorm中的稳定性分析结果

去掉高于1.5阈值的后7个基因,将其余的Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp3、Gph3基因在4 ℃条件下不同生长阶段的扩展青霉菌材料的实时定量PCR数据进行分析。在geNorm和NormFinder软件中稳定性分析排序结果如图4所示。

由图4a可知,除去Knr4的分析值较高,其余4个基因(Isy1、Spt5、Nucb、Hp1)的分析值都低于0.02,具有较高的稳定性,适合作为内参基因。由图4b可知,Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1的分析结果低于geNorm的1.5的阈值条件。综合分析表明,Isy1、Spt5、Nucb、Hp1可以作为合适的内参基因,用于在4、25 ℃条件下,生长36 h以内的扩展青霉菌的基因定量研究。

图4 7个候选内参基因的稳定性分析结果

2.4 内参基因的应用

将Isy1和Spt5基因作为内参基因,分别在PDB液体培养基中,4、25 ℃条件下生长6、12、24 h的扩展青霉菌为实验材料,进行了glycoside hydrolase编码基因Gh30(PEX2-044530)的实时定量PCR实验。Gh30基因的定量引物对如下。

上游引物:5’-CAGTCACCTCCTTCAACACGC-3’;

下游引物:5’-CGCATTGTTCCCATTATCGTC-3’。

以Isy1和Spt5作为内参基因进行Gh30的表达水平定量结果如图5所示。图5中,**表示P<0.01显著性差异。

图5 Isy1和Spt5基因定量的Gh30基因表达水平

由图5可知,在相同系列的试验材料中,Gh30基因显示出一致的表达趋势。表明上述2个基因可以作为内参基因,用于不同温度条件下早期发育阶段(24 h以内)的扩展青霉菌基因表达的定量研究。

3 讨 论

大量研究表明,18S核糖体、内修基因ACT、延伸因子EF-1α基因等传统内参基因不存在绝对的恒定表达,在不同生长发育阶段或不同实验条件处理下的实验材料中,基因表达存在较大的波动[7-9]。

本研究利用转录组数据和实时定量PCR,鉴定得到Isy1、Spt5、Nucb、Hp1基因适合作为不同温度条件下的内参基因，且对Isy1和Spt5基因进行了验证。

目前,得益于测序技术的进步和测序成本的大幅降低,包括NCBI在内的公共数据库中有大量的转录组数据,这对于内参基因的开发提供了大量的基因表达数据以供参考。此外,多种算法联用分析内参基因的稳定性逐渐成为主流,本研究采用geNorm 和 NormFinder软件进行基因表达稳定性分析。目前,基因稳定性分析有多种分析软件可供选择,包括geNorm[10]、NormFinder[11]、BestKeeper[6]。结合2种以上的分析软件,基于不同算法综合进行基因表达稳定性分析,可以取得良好的分析结果。